Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.

A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.

As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos ^1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese³ e espermaiogênese⁴. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos ^5,6,7

1. Determinação da remodelagem da membrana usando vesículas unilamellar gigantes (GUVs)

NOTA: Nesta seção, os GUVs são gerados para imitar as deformações de membrana possivelmente induzidas por septinas em um contexto celular. De fato, nas células, os septinos são frequentemente encontrados em locais com curvaturas de micrômetros. Os GUVs têm tamanhos que variam de alguns a dezenas de micrômetros e podem ser deformados. Assim, são apropriados para avaliar quaisquer.......

Deformações de GUVs
Imagens típicas de fluorescência confocal de GUVs remodeladas após serem incubadas com septinas são exibidas na Figura 3, em condições onde os septins polimerizam. GuVs nus (Figura 3A) eram perfeitamente esféricos. Após a incubação com mais de 50 nM de filamentos de levedura, as vesículas pareciam deformadas. Até uma concentração de octamers de levedura de 100 nM, as vesículas apareceram facetted, e as def.......

Como dito acima, tem sido utilizada uma mistura lipídica que melhora a incorporação de PI(4,5)P₂ dentro da bicamadas lipídica e facilita assim as interações septina-membrana. De fato, mostramos em outros lugares²⁵ que os septinos de levedura brotante interagem com vesículas de forma específica de PI(4,5)P₂. Esta composição lipídica foi ajustada empiricamente a partir da triagem de múltiplas composições e agora é amplamente utilizada pelos autores. Pi(4,5)P_.......

Agradecemos a Patricia Bassereau e Daniel Lévy por seus conselhos e discussões úteis. Este trabalho foi beneficiado com o apoio da ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar o projeto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e o projeto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-011. B. Chauvin é financiado pela Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa foi apoiado pela Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink foi apoiado pelo Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) através do 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Bolsa de gravitação (024.003.019). Agr....