JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Методы «снизу вверх in vitro » для анализа ультраструктурной организации, изменения формы мембраны и чувствительности к кривизне септинов

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Септины являются цитоскелетными белками. Они взаимодействуют с липидными мембранами и могут ощущать, но также генерировать кривизну мембраны в микронном масштабе. В этом протоколе мы описываем методологии снизу вверх in vitro для анализа деформаций мембран, чувствительного к кривизне связывания септина и ультраструктуры септиновой нити.

Ремоделирование мембраны происходит постоянно на плазматической мембране и внутри клеточных органелл. Чтобы полностью проанализировать роль окружающей среды (ионные условия, белковые и липидные композиции, кривизна мембраны) и различных партнеров, связанных со специфическими процессами изменения формы мембраны, мы предпринимаем подходы in vitro снизу вверх. В последние годы наблюдается большой интерес к выявлению роли белков септина, связанных с основными заболеваниями. Септины являются незаменимыми и вездесущими цитоскелетными белками, которые взаимодействуют с плазматической мембраной. Они участвуют в делении клеток, подвижности клеток, нейроморфогенезе и спермиогенезе, среди других функций. Поэтому важно понять, как септины взаимодействуют и организуются на мембранах, чтобы впоследствии индуцировать деформации мембран и как они могут быть чувствительны к определенным кривизнам мембраны. Целью данной статьи является расшифровка взаимодействия между ультраструктурой септинов на молекулярном уровне и ремоделированием мембран, происходящим в микронном масштабе. С этой целью почковые дрожжи и комплексы септина млекопитающих были рекомбинантно экспрессированы и очищены. Комбинация анализов in vitro затем использовалась для анализа самосборки септинов на мембране. Поддерживаемые липидные бислои (SLB), гигантские одноламеллярные везикулы (GUV), большие одноцветные везикулы (LUV) и волнистые субстраты использовались для изучения взаимодействия между самосборкой септина, изменением формы мембраны и кривизной мембраны.

Септины представляют собой цитоскелетные нитеобразующие белки, которые взаимодействуют с липидными мембранами. Септины повсеместно распространены у эукариот и необходимы для многочисленных клеточных функций. Они были идентифицированы как основные регуляторы деления клеток у почковых дрожжей и млекопитающих 1,2. Они участвуют в событиях изменения формы мембраны, цилиогенезе3 и спермиогенезе4. В клетках млекопитающих септины могут также взаимодействовать с актинами и микротрубочками 5,6,7

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Определение изменения формы мембраны с использованием гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе ГУВ генерируются для имитации деформаций мембраны, возможно, индуцированных септинами в клеточном контексте. Действительно, в клетках се.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Деформации ГУВ
Типичные конфокальные флуоресцентные изображения ГУВ, измененные после инкубации с септинами, показаны на рисунке 3 в условиях полимеризации септинов. Голые ГУВ (рисунок 3А) были идеально сферическими. При инкубации с более чем .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как указано выше, была использована липидная смесь, которая усиливает включение PI(4,5)P2 в липидный бислой и, таким образом, облегчает септин-мембранные взаимодействия. Действительно, мы показали в другом месте25 , что почковые дрожжевые септины взаимодействуют с везику?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы благодарим Патрисию Бассеро и Даниэля Леви за их полезные советы и обсуждения. Эта работа была поддержана ANR (Agence Nationale de la Recherche) для финансирования проекта "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 и проекта "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin финансируется Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" и Fondation pour lea Recherche Médicale. К. Накадзава был поддержан Университетом Сорбонны (AAP Emergence). Г.Х. Кёндеринк был поддержан Нидерландской организацией вур Ветеншаппелийк Ондерзоек (NWO/OCW) через «BaSyC-Building a Synthetic Cell». Гравитационный грант (024.003.019). Мы благодарим Labex Cell(n)Scale (ANR-....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved