JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Bottom-Up In Vitro-metoder för att analysera ultrastrukturell organisation, membranomformning och krökningskänslighetsbeteende hos septiner

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Septiner är cytoskelettproteiner. De interagerar med lipidmembran och kan känna av men också generera membrankrökning på mikronskalan. Vi beskriver i detta protokoll bottom-up in vitro-metoder för att analysera membrandeformationer, krökningskänslig septinbindning och septinfilamentultrastruktur.

Membranombyggnad sker ständigt vid plasmamembranet och inom cellulära organeller. För att helt dissekera miljöns roll (joniska förhållanden, protein- och lipidkompositioner, membrankrökning) och de olika partnerna som är associerade med specifika membranomformningsprocesser, genomför vi in vitro-bottom-up-metoder. Under de senaste åren har det funnits ett stort intresse för att avslöja rollen av septinproteiner associerade med stora sjukdomar. Septiner är väsentliga och allestädes närvarande cytoskelettproteiner som interagerar med plasmamembranet. De är inblandade i celldelning, cellmotilitet, neuromorfogenes och spermiogenes, bland andra funktioner. Det är därför viktigt att förstå hur septiner interagerar och organiserar vid membran för att därefter inducera membrandeformationer och hur de kan vara känsliga för specifika membrankrökningar. Denna artikel syftar till att dechiffrera samspelet mellan ultrastrukturen hos septiner på molekylär nivå och membranombyggnaden som sker i mikronskala. För detta ändamål uttrycktes och renades spirande jäst- och däggdjursseptinkomplex rekombinant. En kombination av in vitro-analyser användes sedan för att analysera självmontering av septiner vid membranet. Stödda lipid-dubbelskikt (SLB), gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs), stora unilamellära vesiklar (LUVs) och vågiga substrat användes för att studera samspelet mellan septin-självmontering, membranomformning och membrankrökning.

Septiner är cytoskelettfilamentbildande proteiner som interagerar med lipidmembran. Septiner är allestädes närvarande i eukaryoter och väsentliga för många cellulära funktioner. De har identifierats som de viktigaste regulatorerna för celldelning i spirande jäst och däggdjur 1,2. De är involverade i membranomformningshändelser, ciliogenes3 och spermiogenes4. Inom däggdjursceller kan septiner också interagera med aktin och mikrotubuli 5,6,7 i ett bindemedel a....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bestämning av membranomformning med hjälp av gigantiska unilamellära vesiklar (GUV)

OBS: I detta avsnitt genereras GUVs för att efterlikna membrandeformationerna som eventuellt induceras av septiner i ett cellulärt sammanhang. Faktum är att i celler finns septiner ofta på platser med mikrometerkrökningar. GUVs har storlekar som sträcker sig från några till tiotals mikrometer och kan deformeras. De är således lämpliga för att analysera eventuella septininducerad.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

GUVs deformationer
Typiska konfokala fluorescensbilder av GUVs omformade efter att ha inkuberats med septiner visas i figur 3, under förhållanden där septiner polymeriseras. Nakna GUVs (figur 3A) var perfekt sfäriska. Vid inkubation med mer än 50 nM spirande jästseptinfilament uppträdde vesiklarna deformerade. Upp till en koncentration av 100 nM spirande jästseptinoktamer verkade vesiklarna fasetterade och deformationerna förblev sta.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som nämnts ovan har en lipidblandning använts som förbättrar PI (4,5) P2-införlivandet i lipid-dubbelskiktet och därmed underlättar septin-membraninteraktioner. Faktum är att vi har visat någon annanstans25 att spirande jästseptiner interagerar med vesiklar på ett PI (4,5) P2-specifikt sätt. Denna lipidkomposition justerades empiriskt från screening av flera kompositioner och används nu i stor utsträckning av författarna. PI(4,5)P2-lipider måste ha.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi tackar Patricia Bassereau och Daniel Lévy för deras goda råd och diskussioner. Detta arbete fick stöd från ANR (Agence Nationale de la Recherche) för att finansiera projektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 och projektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin finansieras av Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" och Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa stöddes av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink stöddes av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) genom "BaSyC-Building a Synthetic Cell". Gravitation bidrag (024.003.019). Vi tackar Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LA....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved