JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Septinlerin Ultrayapısal Organizasyonunu, Membran Yeniden Şekillendirmesini ve Eğrilik Duyarlılığı Davranışını Analiz Etmek için Aşağıdan Yukarıya In Vitro Yöntemler

Published: August 17th, 2022

DOI:

10.3791/63889

1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV
* These authors contributed equally

Septinler sitoiskelet proteinleridir. Lipid membranlarla etkileşime girerler ve mikron ölçeğinde membran eğriliğini algılayabilir ancak aynı zamanda üretebilirler. Bu protokolde membran deformasyonlarını, eğriliğe duyarlı septin bağlanmasını ve septin filament ultrayapısını analiz etmek için aşağıdan yukarıya in vitro metodolojileri tanımladık.

Membran yeniden şekillenmesi plazma zarında ve hücresel organellerde sürekli olarak gerçekleşir. Çevrenin rolünü (iyonik koşullar, protein ve lipit bileşimleri, membran eğriliği) ve spesifik membran yeniden şekillendirme süreçleriyle ilişkili farklı ortakları tam olarak incelemek için, in vitro aşağıdan yukarıya yaklaşımlar benimsiyoruz. Son yıllarda, septin proteinlerinin büyük hastalıklarla ilişkili rolünü ortaya çıkarmaya büyük ilgi duyulmaktadır. Septinler, plazma zarı ile etkileşime giren esansiyel ve her yerde bulunan sitoiskelet proteinleridir. Diğer fonksiyonların yanı sıra hücre bölünmesi, hücre hareketliliği, nöro-morfogenez ve spermiogenezde rol oynarlar. Bu nedenle, septinlerin membranlarda nasıl etkileşime girdiğini ve daha sonra membran deformasyonlarını indüklemek için nasıl organize olduklarını ve spesifik membran eğriliklerine nasıl duyarlı olabileceklerini anlamak önemlidir. Bu makale, septinlerin moleküler düzeyde ultra yapısı ile mikron ölçeğinde meydana gelen membran yeniden şekillenmesi arasındaki etkileşimi deşifre etmeyi amaçlamaktadır. Bu amaçla, tomurcuklanan maya ve memeli septin kompleksleri rekombinant olarak eksprese edildi ve saflaştırıldı. Daha sonra membrandaki septinlerin kendi kendine montajını analiz etmek için in vitro testlerin bir kombinasyonu kullanıldı. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler), dev unilamellar veziküller (GUV'lar), büyük unilamellar veziküller (LUV'ler) ve dalgalı substratlar, septinin kendi kendine montajı, membran yeniden şekillendirme ve membran eğriliği arasındaki etkileşimi incelemek için kullanıldı.

Septinler, lipid membranları ile etkileşime giren sitoiskelet filament oluşturan proteinlerdir. Septinler ökaryotlarda her yerde bulunur ve çok sayıda hücresel fonksiyon için gereklidir. Tomurcuklanan maya ve memelilerde hücre bölünmesinin ana düzenleyicileri olarak tanımlanmışlardır 1,2. Membran yeniden şekillendirme olaylarında, siliyogenez3'te ve spermiyogenez4'te rol oynarlar. Memeli hücrelerinde, septinler ayrıca Rho GTPazların (BORG) bağımlı bir şekilde 8 bağlayıcısında aktin ve mikrotübüller5,6,7 i....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) kullanılarak membran yeniden şekillendirmenin belirlenmesi

NOT: Bu bölümde, hücresel bağlamda septinler tarafından indüklenmesi muhtemel membran deformasyonlarını taklit etmek için GUV'lar üretilmektedir. Gerçekten de, hücrelerde, septinler sıklıkla mikrometre eğrilikleri olan bölgelerde bulunur. GUV'lar birkaç ila onlarca mikrometre arasında değişen boyutlara sahiptir ve deforme olabilir. Bu nedenle, mikrometre öl?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

GUV'ların deformasyonları
Septinlerle inkübe edildikten sonra yeniden şekillenen GUV'ların tipik konfokal floresan görüntüleri, septinlerin polimerize olduğu koşullarda Şekil 3'te gösterilmiştir. Çıplak GUV'lar (Şekil 3A) mükemmel bir şekilde küreseldi. 50 nM'den fazla tomurcuklanan maya septin filamentleri ile inkübasyon üzerine, veziküller deforme olmuş olarak ortaya çıktı. 100 nM tomurcuklanan maya septin oktamer .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yukarıda belirtildiği gibi, lipid çift katmanı içinde PI (4,5) P2 ilişkisini artıran ve böylece septin-membran etkileşimlerini kolaylaştıran bir lipit karışımı kullanılmıştır. Gerçekten de,25 başka bir yerde, tomurcuklanan maya septinlerinin veziküllerle PI (4,5) P2'ye özgü bir şekilde etkileşime girdiğini gösterdik. Bu lipit bileşimi, çoklu kompozisyonların taranmasından ampirik olarak ayarlanmıştır ve şimdi yazarlar tarafından yaygın ol.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Patricia Bassereau ve Daniel Lévy'ye yararlı tavsiyeleri ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 projesini ve "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01 projesini finanse etmek için ANR'nin (Agence Nationale de la Recherche) desteğinden yararlandı. B. Chauvin Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" ve Fondation pour lea Recherche Médicele tarafından finanse edilmektedir. K. Nakazawa, Sorbonne Université (AAP Emergence) tarafından desteklendi. G.H. Koenderink, Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) tarafından 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' aracılığıyla desteklendi. Y....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840035
Bath sonicatorElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramideinvitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanolSigma Aldrich
Confocal microscopenikonspinning disk or confocal
Critical point dryerLeica microsystemsCPD300
Deionized water generatorMilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholineAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solutionThermo Fischer scientific50-262-19
High vacuum grease, Dow corningVWR
IMOD softwarehttps://bio3d.colorado.edu/imod/software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy gridsEloise01883-F
LipidsAvanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046
Metal evaporatorLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%delta microscopies19170
OsmometerLöser15 M
Plasma cleanerAlcatelpascal 2005 SD
Plasma generatorElectron Microscopy Science
Plunge freezing equipmentleica microsystemsEMGP
Transmission electron microscopeThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22451this product is not available for purchase any longer
Wax plates, VitrexVWR

  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
  3. Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
  4. Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
  5. Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
  6. Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
  7. Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
  8. Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
  9. Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
  10. Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
  11. Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
  12. Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
  13. Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
  14. Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
  15. Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
  16. Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
  17. Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
  18. Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
  19. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
  22. Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
  23. Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
  24. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  25. Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
  26. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
  29. Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
  30. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
  31. Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
  32. Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
  33. Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved