Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
אינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואיסוף של רקמות מעורבות
דלקת במשטח העין פוגעת ברקמות פני השטח של העין ופוגעת בתפקודים חיוניים של העין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת דלקת עיניים ולאיסוף רקמות פגועות במודל עכברי של תפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD).
מחלות פני השטח של העין כוללות מגוון של הפרעות המפריעות לתפקודים ולמבנים של הקרנית, הלחמית ורשת בלוטת פני השטח של העין הקשורה. בלוטות Meibomian (MG) מפרישות שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק המימי של סרט הדמעות. נויטרופילים ומלכודות דנ"א חוץ-תאיות מאכלסים את MG ואת משטח העין במודל עכברי של מחלת עיניים אלרגית. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי החופה את שקעי MG וממתנת תפקוד לקוי של MG. כאן, שיטה לגרימת דלקת פני השטח של העין ותפקוד לקוי של MG מוצגת. ההליכים לאיסוף איברים הקשורים למשטח העין, כגון הקרנית, הלחמית והעפעפיים, מתוארים בפירוט. באמצעות טכניקות מבוססות לעיבוד כל איבר, מוצגות גם התכונות המורפולוגיות וההיסטופתולוגיות העיקריות של תפקוד לקוי של MG. הפרשות עיניים מציעות את ההזדמנות להעריך את המצב הדלקתי של משטח העין. נהלים אלה מאפשרים לחקור התערבויות אנטי דלקתיות אקטואליות ומערכתיות ברמה הפרה-קלינית.
כל הרף עין מחדש את שכבת הדמעות החלקה המפוזרת על הקרנית. אפיתליה של פני השטח של העין מקלה על ההתפלגות והכיוון הנכון של סרט הדמעות על משטח העין. מוצינים מסופקים על ידי תאי אפיתל הקרנית והלחמית כדי לסייע במיקום החלק המימי של סרט הדמעות המגיע מבלוטות הדמעות על פני העיניים. לבסוף, MG מפרישה שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק מימי של סרט הדמעות 1,2,3. באופן זה, הפונקציות המתואמות של כל איברי העין מגינות על משטח העין מפני פלישה לפתוגנים או פציעה ותומכות בראייה צלולה ללא כל כאב או אי נוחות.
במשטח עיניים בריא, הפרשות העיניים הזורמות או ריאה העין....
כל ההליכים המערבים בעלי חיים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות לרווחת בעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר-ארלנגן-נירנברג (FAU) (מספר היתר: 55.2.2-2532-2-1217). נקבות C57Bl/6 עכברים, בגילאי 7-9 שבועות שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומ?.......
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הרציפים לביסוס מודל מורין של דלקת פני השטח של העין. מטרת הפרוטוקולים היא להראות כיצד ליישם טיפולים באופן מקומי, להשיג הפרשת עיניים ולהוציא איברים נלווים כגון עפעפיים בריאים ודלקתיים (איור 2), הקרנית והלחמית. יש לשים לב כאשר העפעפיים העליונים.......
ההפרשה השומנית של בלוטות Meibomian היא בעלת חשיבות רבה לעין בריאה22. עם זאת, החסימה של בלוטות החלב הללו על ידי מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות מצטברות (aggNETs) המיישרות קו כגדילים מקבילים הממוקמים על הלוחות הטרסליים של שני העפעפיים יכולה לשבש את סרט הדמעות23. הפרעה זו גורמ?.......
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) 2886 פרויקט PANDORA No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), פרויקט H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, ועל ידי קרן פולקסווגן (מענק 97744) ל- MH.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
- Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
- Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
- Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
- Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
- Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
- Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
- Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
- DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
- Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
- Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
- Nien, C. J., et al. Age-related changes in the meibomian gland. Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).
- Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
- Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
- Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
- Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
- Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
- Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
- Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
- Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
- Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
- Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
- Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
- Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
- Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
- Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
- Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
- McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
- Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
- Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
- Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
- Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
- von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
- Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved