Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biochemistry
Dit artikel presenteert een protocol voor de vorming van microtubule-assemblages in de vorm van tactoïden met behulp van MAP65, een plantaardige microtubule crosslinker, en PEG als een crowding agent.
Het cytoskelet is verantwoordelijk voor grote interne organisatie en reorganisatie binnen de cel, allemaal zonder een manager om de veranderingen te sturen. Dit is vooral het geval tijdens mitose of meiose, waarbij de microtubuli de spil vormen tijdens de celdeling. De spil is de machinerie die wordt gebruikt om genetisch materiaal te scheiden tijdens celdeling. Om zelfgeorganiseerde spindels in vitro te creëren, hebben we onlangs een techniek ontwikkeld om microtubuli te reconstitueren tot spindelachtige assemblages met een minimale set microtubuli-geassocieerde eiwitten en verdringingsmiddelen. Specifiek werd MAP65 gebruikt, een antiparallel microtubule crosslinker van planten, een homoloog van Ase1 van gist en PRC1 van zoogdierorganismen. Deze crosslinker organiseert zelf microtubuli in lange, dunne, spindelachtige microtubuli zelfgeorganiseerde assemblages. Deze assemblages zijn ook vergelijkbaar met vloeibare kristal tactoïden, en microtubuli kunnen worden gebruikt als mesoschaal mesogenen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van deze microtubule tactoïden, evenals voor het karakteriseren van de vorm van de assemblages met behulp van fluorescentiemicroscopie en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van fluorescentieherstel na fotobleaching.
Celdeling via mitose is een van de belangrijkste biologische processen om het leven in stand te houden. De microtubule filamenten, samengesteld uit tubuline dimeren, zijn essentiële structurele elementen van dit proces. De voorbijgaande machinerie die in de metafase wordt gecreëerd wanneer de chromosomen in het celcentrum worden uitgelijnd, wordt de mitotische spindel genoemd vanwege zijn vorm, die lijkt op een spindel van een weefgetouw bedekt met draden (figuur 1A). Het is bij veel organismen goed ingeburgerd dat microtubuli in de metafase worden gebruikt om gecondenseerde chromosomen in het midden van de cel te duwen en te trekken, ze uit te lijnen en ze aan te sluiten op microtubuli die ze in de anafase uit elkaar zullen trekken (figuur 1B, C). De spindel vormt zich in zowel meiose (figuur 1B) als mitose (figuur 1C), ontstaan uit vele overlappende microtubuli die niet als draad om de centrale as zijn gewikkeld, maar parallel aan de interface lopen. Het creëren van deze op microtubuli gebaseerde structuren vereist geassocieerde eiwitten die crosslinken en geassocieerde enzymen die kunnen fungeren als motoren om de chromosomen te duwen en te trekken1.
Studies van meiotische spindels hebben aangetoond dat de microtubuli kort, dynamisch en overlappend zijn in crosslinked arrays 2,3,4,5,6 (Figuur 1Di). Door de fysische organisatie van deze korte microtubuli is de meiotische spindel vergelijkbaar met een vloeibaar kristal tactoïde (figuur 1E). Van spindels is inderdaad aangetoond dat ze samensmelten en samensmelten, zoals men zou verwachten van vloeibare kristaltatoïden5.
Veel studies die dateren uit de jaren 1960 hebben fixatie, seriële secties en elektronenmicroscopie gebruikt om te bepalen dat er twee soorten microtubuli in de mitotische spindel 7,8,9,10 zijn. Het eerste type wordt de kinetochore microtubuli genoemd, die de spindelpool verbinden met het kinetochore. Het tweede type wordt de interpolaire of polaire microtubuli genoemd, die voorbij de chromosomen groeien en elkaar overlappen in de midzone (figuur 1Dii)8,9,10. Een derde type wordt de astrale microtubuli genoemd, die zich buiten de spil bevinden en de polen verbinden met de celrand; deze microtubuliorganisaties vallen buiten het bestek van de huidige discussie. Er zijn recente studies geweest naar de interactie tussen augmin6 en gamma-tubuline ringcomplex dat nucleatiecentra voor microtubuli beïnvloedt, wat resulteert in een mitotische spindel met kortere microtubuli zoals in figuur 1D.
Omdat microtubuli langer zijn dan ze breed zijn, met een hoge beeldverhouding en hoge stijfheid, zijn ze als opgeschaalde versies van vloeibare kristalmoleculen. In de fysica van zachte materie zijn atomen en moleculen benaderd met behulp van minimale interacties om de fysische mechanismen van faseovergangen af te leiden, waaronder nucleatie en het smelten van kristallen11. Evenzo zijn microtubuli mesoschaalobjecten die opgeschaalde versies zijn van vloeibare kristalmoleculen, die inzicht geven in de fysica van vloeibare kristaldynamica, inclusief de nucleatie en groei van de nematische fasen van isotrope fasen. Verder, zoals hierboven besproken, vertoont de meiotische spindel eigenschappen zoals die van een vloeibaar kristal tactoïde, een nematische toestand die nucleeert en groeit uit de isotrope toestand van vloeibare kristalmoleculen 3,4,5. Voor tactoïden zijn nucleatie en groei vergelijkbaar met die van andere kristallen (d.w.z. een relatief hoge concentratie mesogenen vereisen [de moleculen die vloeibare kristallen vormen]). De unieke "spindel" vorm van de tactoïde komt van de lokale uitlijning van de vloeibare kristal mesogenen die uitlijnen in de nematische fase (figuur 1E). Ze kunnen geen afgerond kristal vormen omdat de moleculen zeer asymmetrisch zijn. Gezien de aard van de microtubuli is het misschien niet verwonderlijk dat de mitotische spindelmachinerie gemaakt van een hoge lokale concentratie microtubuli ook dezelfde vorm heeft, of het nu een tactoïde of een spindel wordt genoemd. Tactoïden kunnen bipolair zijn, met polen aan de taps toelopende uiteinden (figuur 1Ei), of homogeen, met polen effectief op oneindig (figuur 1Eii).
Gezien het belang van spindelvorming, zijn er inspanningen geleverd voor zelfgeorganiseerde spindelvorming in vitro door microtubulecondensatie in bundels aan te tonen via ionische soorten12,13, verdringingsmiddelen die uitputtingsinteracties creëren14,15, en specifieke microtubule crosslinking eiwitten 13,16,17,18,19, 21. Verrassend genoeg, hoewel deze middelen allemaal werken om de lokale concentratie van microtubuli te verhogen, resulteren ze vaak in lange microtubulibundels, maar niet in tactoïden. Een reden waarom deze bundels lang zijn, zou kunnen zijn dat de microtubuli waaruit ze bestaan ook lang zijn. Recent werk met kortere microtubuli meldde ook langere bundels die aan het einde niet taps toelopend zijn15; in dit geval worden de bundels bij elkaar gehouden met motoreiwitten die verlenging van de bundels veroorzaken en daardoor langer maken. Korte microtubuli met niet-extensiele crosslinkers zijn nodig voor taps toelopende, spindelachtige assemblages, zoals hier beschreven.
Onlangs hebben we een techniek ontwikkeld om de creatie van microtubule tactoïden mogelijk te maken met behulp van de antiparallel crosslinker, MAP65, in de aanwezigheid van nucleating stabiele microtubules22. De microtubuli moesten kort zijn, maar weinig bekende regulatoren van microtubulilengte kunnen microtubuli afdekken tegen dynamische instabiliteit of end-to-end gloeien. In plaats daarvan werd GMPCPP gebruikt om de filamenten na groei te nucleeren en te stabiliseren. Dit maakte het mogelijk om een hoge dichtheid van korte microtubuli te creëren die zichzelf konden organiseren in tactoïden. Deze tactoïden waren homogeen wanneer ze onder birefringence werden bekeken. Naast korte microtubuli werd een specifieke antiparallel crosslinker, MAP65, gebruikt om de tactoïden te vormen (figuur 2). MAP65 is een plantaardig microtubule-geassocieerd eiwit in de PRC1/Ase1 familie van mitotische crosslinkers23. MAP65 bestaat als een dimeer, met een sterke affiniteit om aan zichzelf te binden, evenals de microtubuli24. In tegenstelling tot de meiotische spindel en tactoïden waargenomen met actinefilamenten 25,26,27, die bipolair zijn en de vloeistofachtige eigenschappen van vloeibare kristallen hebben, zijn microtubuli tactoïden waargenomen als vast-achtig22,28.
Hier worden protocollen gepresenteerd voor het maken van de microtubule tactoïden en het karakteriseren van de vorm van de assemblages en de mobiliteit van de bestanddelen met behulp van op fluorescentie gebaseerde technieken.
OPMERKING: Tenzij anders vermeld, kunnen delen van het experiment worden uitgevoerd op een laboratoriumbank met de juiste beschermingsmiddelen (handschoenen).
1. Coverslip silanisatie
OPMERKING: Coverslips moeten worden gesiliciseerd om te worden gebruikt met de polymeerborstelcoating die in deze experimenten wordt gebruikt. Dit is een hydrofobe silanisatiebehandeling waarmee een blokcopolymeer met een hydrofoob centraal blok kan binden en een polymeerborstel kan maken. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast om blootstelling aan giftige dampen tijdens het dragen van handschoenen te voorkomen. Dimethyldichlorolsilaan is zeer giftig en moet met de grootste zorg worden behandeld.
2. Tubuline bereiding
OPMERKING: De gekochte tubuline wordt geleverd als een gelyofiliseerd poeder dat niet is geëtiketteerd of is geëtiketteerd met fluoroforen. Gelyofiliseerde tubuline wordt bewaard in een -80 °C vriezer. De volgende procedure wordt gebruikt om ongelabelde tubuline te mengen met gelabeld tubuline in een verhouding die goed is voor visualisatie.
3. MAP65 zuivering
OPMERKING: MAP65 is niet in de handel verkrijgbaar en moet daarom worden gezuiverd voor dit werk. Het protocol is eerder uitgewerkt in verschillende publicaties23,29.
4. Montage van stroomkamers
OPMERKING: Experimenten worden uitgevoerd in stroomkamers gemaakt van een glazen dia en gesiliciseerd afdekglas (figuur 3).
5. Tactoïde experimenten
OPMERKING: Zodra alle reagentia en benodigdheden zijn gegenereerd, kunnen ze worden gebruikt om microtubuli tactoïden in de stroomkamer te nucleeren en te polymeriseren.
6. Fluorescentiemicroscopie
7. Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP)
OPMERKING: Om de mobiliteit van de interne bestanddelen van de tactoïden te bestuderen, werd FRAP gebruikt. FRAP werkt door een geselecteerd deel van rhodamine-gelabelde tubuline en GFP-gelabelde MAP65 tactoïde te fotobleachen en vervolgens het herstel van de fluorescentie met de tijd in dat gebied te observeren. De snelheid van herstel hangt af van de omzet van de soort die wordt gefotobleacheerd. Deze omloopsnelheid kan afhankelijk zijn van diffusie- en bindingsreacties. Voor MAP65-binding aan de tactoïden kunnen bindende wisselkoersen worden geschat. FRAP wordt uitgevoerd met behulp van een extra 405 nm lasersysteem dat de laser in elke vorm kan scannen. Er zijn veel mogelijkheden voor het uitvoeren van FRAP, waaronder het gebruik van de verzonden lamp en het diafragma om een lokaal gebiedte fotograferen 14.
8. Data-analyse
OPMERKING: Kwantitatieve analyse van de beelden van tactoïden werd uitgevoerd om meer te weten te komen over de effecten van omgevingsveranderingen die worden opgelegd via verschillende verdringingsmiddelen, ionische omstandigheden en de toevoeging van andere factoren.
Met slechts een klein aantal componenten, tubulinedimeer en microtubule crosslinkers kunnen microtubule tactoïden ontstaan (figuur 2A). Hoewel dit protocol incubatie beschrijft om te nucleeren en microtubuli te laten groeien in een incubator, kunnen de nucleatie en groei direct onder de microscoop worden waargenomen (die binnen 30 minuten voltooid zijn) (figuur 2B). De concentratie tubuline wordt constant gehouden op 13,6 μm en MAP65-MT binding op 10%.
Figuur 4 vertegenwoordigt succesvolle gegevens. De tactoïden moeten zichtbaar zijn met zowel een 561 nm laser in het tubulinekanaal als 488 nm in het MAP65-kanaal, die elkaar perfect overlappen (figuur 4A). Een mysterie van het systeem is dat de breedte van de tactoïden niet lijkt te variëren onder een verscheidenheid aan experimentele veranderingen, waaronder het veranderen van de microtubulilengtes, de MAP65-concentratie en de verdringingsmiddelen (figuur 4B) 22,28. De lengte is veel variabeler en hangt af van zowel de microtubulilengtes als de MAP65-concentratie (figuur 4B)22,28.
Bij het uitvoeren van FRAP is waargenomen dat het MAP65-signaal herstelt, maar het microtubule-signaal herstelt niet (figuur 5). Het herstel in FRAP is te danken aan de mobiliteit en beweging van de gelabelde en fotobleached objecten. In het geval van de MAP65 dissociëren de verduisterde moleculen zich van de microtubuli en verplaatsen nieuwe zich naar het gebied (figuur 5). De MAP65-binding is in evenwicht, dus de snelheid van binden en ontkoppelen is gelijk (gemeten in moleculen per seconde). Voor de microtubuli werd geen herstel gezien, wat impliceert dat de microtubuli niet in staat zijn om het tactoïde te verlaten (figuur 5A, Bi, C). Verder werd geen verspreiding van het verduisterde gebied gezien, wat suggereert dat de microtubuli lokaal onbeweeglijk zijn en geen vloeistof in de tactoïde vorm.
Figuur 1: Verschillende modellen van spindelvorming. Een mitotische spindel is een machine gemaakt van microtubuli en de bijbehorende eiwitten en enzymen die de chromosomen uitlijnt en scheidt in de twee nieuwe dochtercellen tijdens de celdeling. (A) Afbeelding van een vroege middeleeuwen drop spindel replica met fijn garen uit Nederland. Deze figuur is aangepast van een Wikimedia-afbeelding door Peter van der Sluijs30. (B) Driedimensionale reconstructie van microtubuli in verschillende stadia van wild-type meiose II. Microtubuli worden in het groen weergegeven en chromosomen worden in grijs weergegeven. Schaalbalk = 1 μm. Dit cijfer is aangepast van Lantzsch et al.31. (C) Microscopiebeeld van de microtubuli in een mitotische spil van een delende Sf9-cel. De spindelpolen en de microtubuli van de spil zijn gelabeld met een groen fluorescerend eiwit. Schaalbalk = 5 μm. Dit cijfer is aangepast van Advani et al.32. (D) Verschillende modellen van hoe mitotische en meiotische spindelmicrotubuli zijn georganiseerd. (i) Eerder waargenomen voor meiotische spindels gemaakt van Xenopus-ei-extracten, werden de microtubuli (groen) afgeleid als kort en dynamisch in de hele spil. Dit is vergelijkbaar met een bipolaire tactoïde organisatie in een vloeibaar kristal. (ii) Het canonieke model voor microtubule-organisatie in een mitotische spindel heeft twee soorten microtubuli: interpolaire of polaire microtubuli (donkergroen) die crosslinken in de middenzone rond de chromosomen en kinetochore microtubuli (lichtgroen) die worden gebundeld en uitgerekt van de pool naar het kinetochore om de chromosomen te duwen en te trekken. Op alle afbeeldingen worden chromosomen weergegeven in transparant blauw en spindelpolen in donkergroen. (E) Schema's van mesogenen (groene lijnen) in een vloeibaar kristal tactoïde voor (i) bipolaire en (ii) homogene tactoïden. Bipolaire tactoïden hebben twee polen aan het einde van de tactoïde, en de mesogenen heroriënteren zich om naar die polen te wijzen. Homogene tactoïden hebben polen op oneindig en de mesogenen veranderen niet van oriëntatie langs de lengte van het tactoïde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microtubule condensatie. (A) Microtubuli kunnen worden gebundeld en verknoopt door een verscheidenheid aan methoden, waaronder ionische soorten, uitputtingskrachten veroorzaakt door verdringingsmiddelen en specifieke microtubule crosslinkers, zoals MAP65. (i) Tubulinedimmeren en MAP65-eiwitten worden gemengd tot nucleate en groeien microtubuli. (ii) Microtubuli nucleeren en groeien uit de tubuline, en MAP65 bindt onmiddellijk aan microtubuli, een ander MAP65-monomeer, of beide en veroorzaakt bundeling. (iii) Microtubuli in de verknoopte bundels nucleeren en groeien. (iv) De uiteindelijke configuratie is een microtubuli tactoïde vergelijkbaar met een spindel. (B) Tijdreeksen van microtubuli tactoïden die gedurende 105 minuten nucleeren en groeien. Schaalbalk = 5 μm. Figuur aangepast van Edozie et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stromingskamerassemblage. De stromingskamer is gemaakt met behulp van een glazen schuif, gesiliciseerd afdekglas en permanente dubbelzijdige tape. Het geel gemarkeerde gebied is het stroompad waar het monster wordt gestroomd en waargenomen. Het volume van de stroomkamer is ~ 20 μL. Epoxy werd gebruikt om de uiteinden van de kamer af te dichten om te voorkomen dat het monster verdampt tijdens langdurige beeldvorming gedurende enkele uren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tactoïde afbeeldingen en lengte- en breedteanalyse. (A) Voorbeeldgegevens van tactoïden gevormd zoals beschreven en afgebeeld met behulp van draaiende schijf confocale tonen (i) microtubule kanaal beeldvorming rhodamine-gelabelde tubuline met behulp van een 561 nm laser, (ii) GFP-MAP65 kanaal imaging van de GFP met behulp van een 488 nm laser, en (iii) samengevoegde overlay beeld van de microtubuli kanaal (magenta) en GFP-MAP65 kanaal (cyaan). Overlapgebieden worden weergegeven als wit en tonen aan dat de microtubuli en MAP65 precies colocaliseren. Schaalbalk = 10 μm voor alle afbeeldingen in (A). (B) Kwantificering van de tactoïde lengte en breedte. (i) Afbeelding van een tactoïde die zonder labels moet worden geanalyseerd. Schaalbalk = 5 μm. (ii) Dezelfde afbeelding als in (i), waarbij de lengte (ononderbroken lijn met lijnkappen) en breedte (stippellijn) metingen worden aangegeven. Schaalbalk = 5 μm. (iii) De breedte werd gemeten door het intensiteitsprofiel over het tactoïde te nemen op de loodrechte bisector (stippellijn) aangegeven in (ii). Het intensiteitsprofiel was geschikt voor een Gaussische functie om de amplitude en breedte van het tactoïde te onthullen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve FRAP-gegevens en -analyse. (A) Microscopietijdreeksgegevens van (i) microtubule tactoïde en (ii) GFP-MAP65, en (iii) overlaybeeld van beide kanalen met microtubuli in magenta en GFP-MAP65 in cyaan die werden gefotobleacheerd op tijd 63 s en waargenomen gedurende nog eens 5 minuten. (B) Gekwantificeerde intensiteit van de (i ) microtubulikanaal in het gebleekte gebied (magentacirkels) en de achtergrond (donkergrijze cirkels) en (ii) GFP-MAP65-kanaal in het gebleekte gebied (cyaanvierkanten) en de achtergrond (donkergrijze vierkanten). (C) De gegevens werden gecorrigeerd voor de achtergrondruis en opnieuw geschaald voor het microtubulikanaal (magentacirkels) en het GFP-MAP65-kanaal (cyaanvierkanten). De microtubuli herstellen zich niet, maar de GFP-MAP65 wel en kan worden aangepast (donkergrijze lijn) aan een stijgend exponentieel verval om de amplitude en de tijdschaal van herstel te vinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hier beschreven methoden zijn in verschillende artikelen gebruikt om microtubuli tactoïden te maken (figuur 2)22,28. Deze experimenten zijn biologisch relevant om de organisatieprincipes te helpen ontdekken die de vorm en stabiliteit van de mitotische of meiotische spindel in de meeste celtypen beheersen. Bovendien zijn microtubuli model vloeibare kristal mesogenen die kunnen helpen bij het leren van meer over hoe vloeibare kristallen nucleate en groeien nematische fasen uit isotrope fasen.
De hier beschreven procedure heeft verschillende voordelen voor het verkennen van microtubule zelforganisatie. Ten eerste is het zeer reproduceerbaar, omdat het in het lab is uitgevoerd door veel studenten, waaronder middelbare scholieren, met weinig voorkennis of training voordat ze in het lab begonnen. De tactoïden zijn birefringent22, waardoor ze naast fluorescentiemicroscopie ook in doorgelaten licht kunnen worden bekeken, waardoor deze methode toegankelijk is voor veel laboratoria en deze experimentele procedure kan worden aangepast aan educatieve doeleinden, naast hoogwaardig onderzoek. Ten slotte opent dit proces wegen om biologische systemen te blijven begrijpen en onderzoeken in een uitgeklede, reductionistische benadering, waardoor men kan begrijpen hoe elke aanvullende aandoening, eiwit of additief de zelforganisatie van tactoïden en, misschien, uiteindelijk, de spil kan veranderen. Doelen voor betere biomimicry zijn activiteit, vloeibaarheid en filamentpolariteitssortering.
Er kunnen verschillende factoren zijn die van invloed zijn op het experiment en onverwachte resultaten opleveren. Als de tactoïden zich bijvoorbeeld niet vormen (figuur 2) maar waaierachtige patronen worden waargenomen, is de MAP65 waarschijnlijk niet aanwezig of niet bindend aan de microtubuli22,28. Dit zou ook duidelijk moeten zijn in het MAP65-fluorescentiekanaal, omdat de GFP-MAP65 niet gebonden is aan de microtubuli.
Als de tactoïden zich niet vormen en de achtergrond als spikkels op het glas verschijnt, kan dit te wijten zijn aan de oppervlaktecoating. Eenmaal uitgevoerd, duurt de silanisatie slechts 1 maand op coverslips. Wanneer het slijt, kan de tubuline zich niet-specifiek aan het blootgestelde oppervlak binden. Deze binding zal in vreemde patronen plaatsvinden.
Als de tactoïden zich niet vormen en de tubuline wordt waargenomen in aggregaten van verschillende vormen en maten, kan dit te wijten zijn aan tubuline van slechte kwaliteit. Tubuline kan worden gecentrifugeerd om initiële aggregaten te verwijderen die deze off-pathway aggregatie kunnen aansturen in plaats van microtubule polymerisatie. Als het oppervlak zich aan de tubuline bindt, kan het ook de tubuline in de oplossing uitputten. Lage concentraties tubuline, onder de kritische concentratie voor het polymeriseren van microtubuli, kunnen resulteren in aggregaten.
In FRAP-experimenten, als het MAP65-kanaal geen herstel vertoont (figuur 5), is het mogelijk dat de fotobleaching de microtubuli fotode. Fotoschade veroorzaakt de gelokaliseerde vernietiging van de filamenten. Dit kan worden gecontroleerd door onderzoek in het zendkanaal. Microtubule tactoïden zijn zichtbaar in het overgedragen kanaal door een hoge brekingsindex die niet overeenkomt met het omringende water. Door licht geïnduceerde fotoschade zal verschijnen als een brandmerk of verlies van contrast in doorgelaten lichtbeeldvorming op de locatie van de ROI die wordt blootgesteld aan fotobleaching. Als dit gebeurt, moet de laser- of lichtkracht worden verminderd om de fotoschade van de eiwitten te remmen.
Er waren verschillende uitdagingen in deze procedure en aanpak. Een probleem is dat de lengtemetingen momenteel met de hand worden uitgevoerd door op de afbeelding te klikken. Deze methode, hoewel eenvoudig, kan leiden tot grote onzekerheid. De breedtemeting die de doorsnede gebruikt en past bij een Gauss is een betere methode om de grootte te kwantificeren. Een vergelijkbare methode zou kunnen worden gebruikt voor de lengte. Een tweede probleem is dat de tactoïden, omdat ze zo lang en dun zijn, soms kunnen buigen. Dit maakt het kwantificeren van de lengte moeilijker. De contourlengte kan worden gekwantificeerd met behulp van een gesegmenteerde lijn, maar er is extra onzekerheid telkens wanneer een segment wordt toegevoegd.
Vanuit een wetenschappelijk perspectief heeft deze benadering enkele andere uitdagingen voor het gebruik ervan als model voor vloeibare kristallen of spindels. De eerste uitdaging was de lange, dunne vorm van de tactoïden die microtubuli creëren (figuur 3 en figuur 4). Zoals opgemerkt in eerdere publicaties22, zijn microtubule tactoïden homogene tactoïden, niet bipolair. Dit betekent dat de microtubuli waaruit de vorm bestaat, zich niet heroriënteren om naar de uiteinden van de structuur te wijzen. In plaats daarvan zijn alle microtubuli evenwijdig aan de lange as en bevinden de "polen" zich op oneindig. Dit is heel anders dan de tactoïden die worden waargenomen voor moleculaire vloeibare kristallen of zelfs voor actine of DNA dat ook kan fungeren als vloeibare kristal mesogenen. In deze andere systemen zijn de tactoïden bipolair en, wanneer ze worden bekeken in gekruiste polarisatoren, vertonen ze de veelbetekenende tekenen van heroriëntatie van de staven.
Een tweede grote uitdaging in dit systeem is dat de microtubuli onbeweeglijk zijn in de tactoïde. Dit blijkt duidelijk uit FRAP-experimenten en -analyse omdat het herstel van de microtubuli zeer laag is. Hun vaste aard maakt microtubuli tactoïden minder waardevol dan grootschalige vloeibare kristalanalogen. De nematische fase van een vloeibaar kristal moet zowel vloeibare (vloeistof) als kristal (georganiseerde) eigenschappen hebben. Hoewel de vorm goed lijkt voor de spindel, maakt de immobiliteit het systeem minder opwindend als een model mitotische spindel. Aan de andere kant biedt dit probleem mogelijkheden om te onderzoeken hoe men de experimenten kan aanpassen om meer vloeibaarheid in het systeem te creëren.
Deze wetenschappelijke uitdagingen bieden spannende kansen die nieuwe kennis over het systeem mogelijk maken. Om de microtubuli tactoïden meer bipolair te maken, zou men kortere microtubuli kunnen gebruiken. Er is echter een extra uitdaging, omdat microtubuli niet veel goed gekarakteriseerde capping-eiwitten hebben om de lengte te beheersen zoals actine dat doet. Het gebruik van nucleatie en groei vereist het gebruik van zeer hoge concentraties tubuline en GMPCPP om korte microtubuli te maken. De hoge tubulineconcentratie resulteert in een groter aantal filamenten in het systeem, waardoor het moeilijker wordt om tactoïden van elkaar te scheiden. De toevoeging van nieuwe microtubule cappers, zoals DARPin33, kan helpen bij deze situatie. Het tweede probleem dat de microtubuli onbeweeglijk zijn, kan worden verzacht door de toevoeging van motoreiwitten, zoals kinesine-534, tetrameren van motoren die bij mitose worden gebruikt. Als alternatief kunnen kunstmatige dimeren van dimerische kinesine-1 worden gebruikt15.
Een andere manier om meer vloeibaarheid toe te voegen, zou zijn om de microtubuli hun dynamische instabiliteit te laten uitvoeren, het groeien en krimpen van microtubuli. Momenteel zijn microtubuli die worden bezaaid met stabiele GMPCPP-filamenten en vervolgens dynamische instabiliteit ondergaan, veel langer dan gewenst om een spindel of tactoïde te vormen, wat zou resulteren in zeer lange organisaties zoals fans of bundels. Het toevoegen van microtubule dynamische instabiliteit zou dus zorgvuldig moeten worden gedaan om de tactoïde vorm te behouden. De toevoeging van geassocieerde eiwitten en enzymen die de lengte kunnen regelen, kan dit probleem verminderen. Bijvoorbeeld, het depolymeriseren van kinesines, zoals kinesine-1335, of het scheiden van enzymen, zoals katanine36, zou waarschijnlijk nodig zijn. Deze experimenten zijn complex en moeilijk, hoewel ze zeer inzichtelijk zouden zijn, ongeacht wat de resultaten onthullen. Welke richting toekomstige experimenten ook opgaan, het hier ontwikkelde platform voor het maken van microtubule tactoïden kan nieuwe informatie blootleggen op de fysieke basis van microtubule organisatie.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
De auteurs willen alle leden van het Ross Lab in de zomer van 2021, in het bijzonder K. Alice Lindsay, bedanken voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van NSF BIO-2134215 die S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee en J.L. Ross ondersteunde. Een subsidie van de KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) ondersteunde R. Branch en P. Chauhan gedeeltelijk
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers - treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M - Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers - treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers - treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved