Detektion og kvantificering af tunnelnanorør ved hjælp af 3D-volumenvisningsbilleder

Nylige opdagelser har afsløret, at celler udfører direkte, langtrækkende, intercellulær overførsel via nanoskala, actin-membranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNT'er). TNT'er defineres som åbne, lipid dobbeltlagsomkransede membranforlængelser, der formidler kontinuitet mellem naboceller med diametre på mellem 50 nm og 1 μm. TNT'er blev oprindeligt demonstreret i neuronale celler, men successive undersøgelser har afsløret eksistensen af TNT'er i flere celletyper og sygdomme, såsom neurodegenerative sygdomme, virusinfektioner og kræft. Flere undersøgelser har henvist til tætte, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellem naboceller som TNT'er eller TNT-lignende strukturer.

Belysningen af ultrastruktur med hensyn til membrankontinuitet ved slutpunktet er teknisk udfordrende. Derudover er undersøgelser af cellecellekommunikation udfordrende med hensyn til karakterisering af TNT'er ved hjælp af konventionelle metoder på grund af manglen på specifikke markører. TNT'er defineres primært som F-actinbaserede, åbne membranfremspring. En væsentlig begrænsning er imidlertid, at F-actin er til stede i alle typer fremspring, hvilket gør det udfordrende at skelne TNT'er fra andre fremspring. Et af de bemærkelsesværdige kendetegn ved F-actinbaserede TNT'er er, at disse strukturer svæver mellem to celler uden at røre undergrunden. Derfor kan forskellige F-actinfarvede TNT'er bekvemt skelnes fra andre fremspring såsom filopodia og neuritter baseret på deres svævende mellem celler.

Vi har for nylig vist, at internaliseringen af oligomere amyloid-β_1-42 (oAβ) via actinafhængig endocytose stimulerer aktiveret p21-aktiveret kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen af F-actinholdige TNT'er, der udtrykkes sammen med phospho-PAK1 mellem SH-SY5Y neuronale celler. Denne protokol skitserer en 3D-volumenanalysemetode til at identificere og karakterisere TNT'er fra de fangede z-stack-billeder af F-actin- og phospho-PAK1-immunostained membranfremspring i oAβ-behandlede neuronale celler. Endvidere skelnes TNT'er fra udvikling af neuritter og neuronale udvækst baseret på F-actin- og β-III tubulin-immunostained membranledninger.