Detectie en kwantificering van tunnelende nanobuizen met behulp van 3D-volumeweergaveafbeeldingen

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat cellen directe, intercellulaire overdracht op lange afstand uitvoeren via nanoschaal, actine-membraankanalen, namelijk "tunneling nanobuisjes" (TNT's). TNT's worden gedefinieerd als open einde, lipide bilayer-omcirkelde membraanuitbreidingen die de continuïteit bemiddelen tussen naburige cellen met diameters variërend tussen 50 nm en 1 μm. TNT's werden aanvankelijk aangetoond in neuronale cellen, maar opeenvolgende studies hebben het bestaan van TNT's aangetoond in verschillende celtypen en ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten, virale infecties en kanker. Verschillende studies hebben verwezen naar close-ended, elektrisch gekoppelde membraan nanostructuren tussen naburige cellen als TNT's of TNT-achtige structuren.

De opheldering van ultrastructuur in termen van membraancontinuïteit op het eindpunt is technisch uitdagend. Bovendien zijn studies over cel-celcommunicatie een uitdaging in termen van de karakterisering van TNT's met behulp van conventionele methoden vanwege het ontbreken van specifieke markers. TNT's worden voornamelijk gedefinieerd als op F-actine gebaseerde, open membraanuitsteeksels. Een belangrijke beperking is echter dat F-actine aanwezig is in alle soorten uitsteeksels, waardoor het een uitdaging is om TNT's van andere uitsteeksels te onderscheiden. Een van de opmerkelijke kenmerken van op F-actine gebaseerde TNT's is dat deze structuren tussen twee cellen zweven zonder het substraat aan te raken. Daarom kunnen verschillende F-actine-gekleurde TNT's gemakkelijk worden onderscheiden van andere uitsteeksels zoals filopodia en neurieten op basis van hun zweven tussen cellen.

We hebben onlangs aangetoond dat de internalisatie van oligomere amyloïde-β_1-42 (oAβ) via actine-afhankelijke endocytose geactiveerde p21-geactiveerde kinase-1 (PAK1) stimuleert, wat de vorming van F-actine-bevattende TNT's bemiddelt die gecoexpresseerd zijn met fosfo-PAK1 tussen SH-SY5Y neuronale cellen. Dit protocol schetst een 3D-volumeanalysemethode om TNT's te identificeren en te karakteriseren uit de vastgelegde z-stackbeelden van F-actine- en fosfo-PAK1-immunogekleurde membraanuitsteeksels in met oAβ behandelde neuronale cellen. Verder onderscheiden TNT's zich van het ontwikkelen van neurieten en neuronale uitwassen op basis van F-actine- en β-III tubuline-immunostained membraankanalen.