Rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View

Recenti scoperte hanno rivelato che le cellule eseguono un trasferimento intercellulare diretto, a lungo raggio, tramite condotti su nanometria, membrana di actina, vale a dire "nanotubi tunneling" (TNT). I TNT sono definiti come estensioni di membrana a doppio strato lipidico aperte che mediano la continuità tra cellule vicine di diametro compreso tra 50 nm e 1 μm. I TNT sono stati dimostrati inizialmente nelle cellule neuronali, ma studi successivi hanno rivelato l'esistenza di TNT in diversi tipi di cellule e malattie, come malattie neurodegenerative, infezioni virali e cancro. Diversi studi hanno fatto riferimento a nanostrutture di membrana chiuse e accoppiate elettricamente tra cellule vicine come TNT o strutture simili al TNT.

La spiegazione dell'ultrastruttura in termini di continuità della membrana all'endpoint è tecnicamente impegnativa. Inoltre, gli studi sulla comunicazione cellula-cellula sono impegnativi in termini di caratterizzazione dei TNT utilizzando metodi convenzionali a causa della mancanza di marcatori specifici. I TNT sono principalmente definiti come protrusioni di membrana aperte a base di F-actina. Tuttavia, una delle principali limitazioni è che la F-actina è presente in tutti i tipi di protrusioni, rendendo difficile differenziare i TNT da altre protrusioni. Una delle caratteristiche notevoli dei TNT a base di F-actina è che queste strutture si librano tra due cellule senza toccare il substrato. Pertanto, TNT distinti colorati con F-actina possono essere convenientemente distinti da altre sporgenze come filopodi e neuriti in base al loro librarsi tra le cellule.

Abbiamo recentemente dimostrato che l'internalizzazione dell'amiloide-β oligomerica_1-42 (oAβ) attraverso l'endocitosi actina-dipendente stimola la chinasi-1 attivata da p21 attivata (PAK1), che media la formazione di TNT contenenti F-actina coespressi con fosfo-PAK1 tra cellule neuronali SH-SY5Y. Questo protocollo delinea un metodo di analisi del volume 3D per identificare e caratterizzare i TNT dalle immagini z-stack catturate di protrusioni di membrana immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 in cellule neuronali trattate con oAβ. Inoltre, i TNT si distinguono dallo sviluppo di neuriti e escrescenze neuronali basate su condotti di membrana con tubazione tubulinica F-actina e β-III.