3Dボリュームビュー画像を用いたトンネルナノチューブの検出と定量

最近の発見により、細胞はナノスケールのアクチン膜導管、すなわち「トンネリングナノチューブ」(TNT) を介して 直接、長距離、細胞間移動を行うことが明らかになりました。TNTは、直径50 nmから1 μmの範囲の隣接細胞間の連続性を媒介する、オープンエンドの脂質二重層で囲まれた膜伸長として定義されます。 TNTは当初神経細胞で実証されましたが、連続した研究により、神経変性疾患、ウイルス感染、癌など、いくつかの細胞型および疾患におけるTNTの存在が明らかになりました。いくつかの研究では、隣接する細胞間のクローズエンドの電気的に結合された膜ナノ構造をTNTまたはTNT様構造と呼んでいます。

エンドポイントでの膜連続性の観点からの微細構造の解明は技術的に困難です。さらに、細胞間コミュニケーションに関する研究は、特異的マーカーがないため、従来の方法を使用したTNTの特性評価の観点から困難です。TNTは、主にFアクチンベースのオープンエンド膜突起として定義されます。ただし、大きな制限の1つは、F-アクチンがすべてのタイプの突起に存在するため、TNTを他の突起と区別することが難しいことです。F-アクチンベースのTNTの注目すべき特徴の1つは、これらの構造が基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングすることです。したがって、明確なFアクチン染色TNTは、細胞間のホバリングに基づいて、糸状足や神経突起などの他の突起と便利に区別できます。

我々は最近、アクチン依存性エンドサイトーシスを介したオリゴマーアミロイドβ_1-42(oAβ)の内在化が、SH-SY5Y神経細胞間でホスホPAK1と共発現するF-アクチン含有TNTの形成を媒介する活性化p21活性化キナーゼ-1(PAK1)を刺激することを示した。このプロトコルは、oAβ処理された神経細胞におけるF-アクチンおよびホスホ-PAK1免疫染色膜突起のキャプチャされたzスタック画像からTNTを同定および特性評価するための3D体積分析方法の概要を示しています。さらに、TNTは、F-アクチンおよびβ-IIIチューブリン免疫染色膜導管に基づく神経突起およびニューロン増殖の発生とは区別されます。