Deteksjon og kvantifisering av tunnelerende nanorør ved hjelp av 3D-volumvisningsbilder

Nylige funn har avslørt at celler utfører direkte, langdistanse, intercellulær overføring via nanoskala, aktinmembranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNTs). TNT er definert som åpne, lipid dobbeltlagsomkransede membranutvidelser som formidler kontinuitet mellom naboceller med diametre mellom 50 nm og 1 μm. TNT ble først demonstrert i nevronceller, men suksessive studier har avslørt eksistensen av TNT i flere celletyper og sykdommer, som nevrodegenerative sykdommer, virusinfeksjoner og kreft. Flere studier har referert til nære, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellom naboceller som TNT eller TNT-lignende strukturer.

Belysning av ultrastruktur i form av membrankontinuitet ved endepunktet er teknisk utfordrende. I tillegg er studier på celle-cellekommunikasjon utfordrende når det gjelder karakterisering av TNT ved bruk av konvensjonelle metoder på grunn av mangel på spesifikke markører. TNT er primært definert som F-aktinbaserte, åpne membranfremspring. En stor begrensning er imidlertid at F-aktin er tilstede i alle typer fremspring, noe som gjør det utfordrende å skille TNT fra andre fremspring. En av de bemerkelsesverdige egenskapene til F-aktinbaserte TNT-er er at disse strukturene svever mellom to celler uten å berøre substratumet. Derfor kan distinkte F-aktinfargede TNT-er enkelt skilles fra andre fremspring som filopodi og nevritter basert på at de svever mellom celler.

Vi har nylig vist at internalisering av oligomer amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinavhengig endocytose stimulerer aktivert p21-aktivert kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen av F-aktinholdige TNTer coexpressed med fosfo-PAK1 mellom_SH-SY5Y nevronceller. Denne protokollen skisserer en 3D-volumanalysemetode for å identifisere og karakterisere TNT-er fra de fangede z-stack-bildene av F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained membranfremspring i oAβ-behandlede nevronceller. Videre skiller TNTer seg fra å utvikle nevritter og nevronale utvekster basert på F-aktin- og β-III tubulinimmunostained membranledninger.