Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View

Недавние открытия показали, что клетки выполняют прямой, дальний, межклеточный перенос через наноразмерные, актин-мембранные каналы, а именно «туннельные нанотрубки» (TNT). ТНТ определяются как открытые, липидные двухслойные мембранные расширения, которые опосредуют непрерывность между соседними клетками диаметром от 50 нм до 1 мкм. ТНТ были продемонстрированы первоначально в нейрональных клетках, но последовательные исследования выявили существование ТНТ в нескольких типах клеток и заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания, вирусные инфекции и рак. В нескольких исследованиях упоминались близкие, электрически связанные мембранные наноструктуры между соседними клетками как TNT или TNT-подобные структуры.

Выяснение ультраструктуры с точки зрения непрерывности мембраны в конечной точке является технически сложной задачей. Кроме того, исследования клеточно-клеточной коммуникации являются сложными с точки зрения характеристики ТНТ с использованием обычных методов из-за отсутствия специфических маркеров. ТНТ в первую очередь определяются как открытые мембранные протрузии на основе F-актина. Однако одним из основных ограничений является то, что F-актин присутствует во всех типах выступов, что затрудняет дифференциацию ТНТ от других выступов. Одной из примечательных характеристик ТНТ на основе F-актина является то, что эти структуры парят между двумя клетками, не касаясь субстрата. Таким образом, различные F-актин-окрашенные ТНТ можно удобно отличить от других выступов, таких как филоподии и нейриты, на основе их парения между клетками.

Недавно мы показали, что интернализация олигомерного амилоид-β_1-42 (oAβ) через актин-зависимый эндоцитоз стимулирует активированную р21-активированную киназу-1 (PAK1), которая опосредует образование F-актин-содержащих ТНТ, совместно экспрессируемых с фосфо-PAK1 между нейрональными клетками SH-SY5Y. Этот протокол описывает метод 3D-объемного анализа для идентификации и характеристики ТНТ по захваченным z-стековым изображениям F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных мембранных протрузий в нейронных клетках, обработанных oAβ. Кроме того, ТНТ отличаются от развивающихся нейритов и нейрональных выростов на основе F-актин- и β-III тубулин-иммуноокрашенных мембранных каналов.