Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D

Descubrimientos recientes han revelado que las células realizan una transferencia intercelular directa y de largo alcance a través de conductos de membrana de actina a nanoescala, a saber, "nanotubos de túnel" (TNT). Los TNT se definen como extensiones de membrana abiertas rodeadas de bicapa lipídica que median la continuidad entre células vecinas de diámetros que oscilan entre 50 nm y 1 μm. Los TNT se demostraron inicialmente en células neuronales, pero estudios sucesivos han revelado la existencia de TNT en varios tipos de células y enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones virales y cáncer. Varios estudios se han referido a nanoestructuras de membrana cerradas y acopladas eléctricamente entre células vecinas como TNT o estructuras similares a TNT.

La elucidación de la ultraestructura en términos de continuidad de la membrana en el punto final es técnicamente desafiante. Además, los estudios sobre la comunicación célula-célula son desafiantes en términos de la caracterización de TNT utilizando métodos convencionales debido a la falta de marcadores específicos. Los TNT se definen principalmente como protuberancias de membrana abiertas basadas en actina F. Sin embargo, una limitación importante es que la actina F está presente en todos los tipos de protuberancias, lo que dificulta la diferenciación de los TNT de otras protuberancias. Una de las características notables de los TNT basados en actina F es que estas estructuras flotan entre dos células sin tocar el sustrato. Por lo tanto, los distintos TNT teñidos con actina F se pueden distinguir convenientemente de otras protuberancias como los filopodios y las neuritas en función de su flotación entre las células.

Recientemente hemos demostrado que la internalización de la β amiloide oligomérica 1-42 (oAβ) a través de endocitosis dependiente de actina estimula la quinasa-1 activada por p21 activada (PAK1), que media la formación de TNT que contienen actina F coexpresados con fosfo-PAK1 entre las células neuronales_SH-SY5Y. Este protocolo describe un método de análisis de volumen 3D para identificar y caracterizar TNT a partir de las imágenes capturadas de la pila z de protuberancias de membrana inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 en células neuronales tratadas con oAβ. Además, los TNT se distinguen del desarrollo de neuritas y excrecencias neuronales basadas en conductos de membrana inmunoteñidos con tubulina F-actina y β-III.