Detektion och kvantifiering av tunnelnanorör med hjälp av 3D-volymvybilder

Nya upptäckter har avslöjat att celler utför direkt, långdistans, intercellulär överföring via nano-skala, aktinmembranledningar, nämligen "tunneling nanotubes" (TNT). TNT definieras som öppna, lipid-dubbelskiktade membranförlängningar som förmedlar kontinuitet mellan angränsande celler med diametrar mellan 50 nm och 1 μm. TNT demonstrerades initialt i neuronala celler, men successiva studier har avslöjat förekomsten av TNT i flera celltyper och sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, virusinfektioner och cancer. Flera studier har hänvisat till nära, elektriskt kopplade membrannanostrukturer mellan angränsande celler som TNT eller TNT-liknande strukturer.

Belysningen av ultrastruktur när det gäller membrankontinuitet vid slutpunkten är tekniskt utmanande. Dessutom är studier om cell-cellkommunikation utmanande när det gäller karakterisering av TNT med konventionella metoder på grund av bristen på specifika markörer. TNT definieras främst som F-aktinbaserade, öppna membranutsprång. En stor begränsning är dock att F-aktin finns i alla typer av utsprång, vilket gör det utmanande att skilja TNT från andra utsprång. En av de anmärkningsvärda egenskaperna hos F-aktinbaserade TNT är att dessa strukturer svävar mellan två celler utan att röra vid underlaget. Därför kan distinkta F-aktinfärgade TNT bekvämt särskiljas från andra utsprång såsom filopodier och neuriter baserat på deras svävande mellan celler.

Vi har nyligen visat att internaliseringen av oligomera amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinberoende endocytos stimulerar aktiverat p21-aktiverat kinas-1 (PAK1), som förmedlar bildandet av F-aktininnehållande TNT samuttryckta med fosfo-PAK1 mellan_SH-SY5Y neuronala celler. Detta protokoll beskriver en 3D-volymanalysmetod för att identifiera och karakterisera TNT från de tagna z-stackbilderna av F-aktin- och fosfo-PAK1-immunfärgade membranutsprång i oAβ-behandlade neuronala celler. Vidare skiljer sig TNT från att utveckla neuriter och neuronala utväxter baserade på F-aktin- och β-III tubulinimmunfärgade membranledningar.