Uso della bisezione per ridurre il DNA mitocondriale nell'ovocita bovino

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per ridurre significativamente il numero di copie del DNA mitocondriale in un ovocita bovino (P < 0,0001). Questo metodo utilizza la centrifugazione e la bisezione per ridurre sostanzialmente i mitocondri degli ovociti e può consentire una maggiore possibilità di sviluppo negli embrioni di trasferimento nucleare delle cellule somatiche interspecie ricostruiti.

Abstract

Il trasferimento nucleare di cellule somatiche interspecie (iSCNT) può essere utilizzato per salvare specie in via di estinzione, ma esistono due distinte popolazioni di DNA mitocondriale (mtDNA) all'interno dell'embrione ricostruito: una all'interno dell'ooplasma ricevente e una all'interno della cellula somatica donatrice. Questa eteroplasmia mitocondriale può portare a problemi di sviluppo nell'embrione e nel feto. I protocolli di clonazione fatti a mano includono la bisezione degli ovociti, che può essere utilizzata per ridurre il numero di copie del mtDNA, riducendo il grado di eteroplasmia mitocondriale in un embrione ricostruito. La centrifugazione di ovociti bovini maturi denudati ha prodotto una frazione densa di mitocondri visibile a un polo dell'ovocita. Le zonae pellucidae degli ovociti sono state rimosse mediante esposizione a una soluzione di pronasi. La bisezione è stata eseguita utilizzando una microlama per rimuovere la frazione mitocondriale visibile. qPCR è stato utilizzato per quantificare il mtDNA presente in campioni di DNA estratti da ovociti interi e ooplasti tagliati in due, fornendo un confronto dei numeri di copie del mtDNA prima e dopo la bisezione. I numeri di copia sono stati calcolati utilizzando i valori di soglia del ciclo, la formula della linea di regressione di una curva standard e un rapporto che includeva le rispettive dimensioni dei prodotti MTDNA PCR e dei prodotti PCR genomici. Un ovocita bovino aveva un numero medio di copie di mtDNA (deviazione standard ±) di 137.904 ± 94.768 (n = 38). Un ooplasto impoverito di mitocondri aveva un numero medio di copie di mtDNA di 8.442 ± 13.806 (n = 33). Le copie medie di mtDNA presenti in un ooplasto ricco di mitocondri erano 79.390 ± 58.526 copie di mtDNA (n = 28). Le differenze tra queste medie calcolate indicano che la centrifugazione e la successiva bisezione possono ridurre significativamente il numero di copie di mtDNA presenti nell'ooplasto impoverito di mitocondri rispetto all'ovocita originale (P < 0,0001, determinato da ANOVA unidirezionale). La riduzione del mtDNA dovrebbe diminuire il grado di eteroplasmia mitocondriale in un embrione ricostruito, favorendo eventualmente lo sviluppo embrionale e fetale standard. L'integrazione con estratto mitocondriale dalla cellula somatica donatrice può anche essere essenziale per ottenere uno sviluppo embrionale di successo.

Introduction

Il trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) include la fusione di un ovocita enucleato da un animale e una cellula somatica da un animale della stessa specie. Nella maggior parte dei casi, l'ovocita e la cellula somatica provengono dalla stessa specie e i tassi di natalità vivi sono inferiori al 6%¹. Alcune ricerche prevedono l'uso di SCNT interspecie (iSCNT), che include la fusione di una cellula somatica e di un ovocita che provengono da due specie diverse. In questi studi, i tassi di natalità vivi sono ancora più bassi rispetto a SCNT, in genere inferiori all'1%¹. Tuttavia, iSCNT ha la capacità di essere uti....

Protocol

Il seguente protocollo segue le linee guida per la cura e l'etica degli animali fornite dalla Utah State University.

1. Preparazione dei media

1. Prima della manipolazione degli ovociti, preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: 400 μL di soluzione di ialuronidasi, 500 μL di mezzi T2, 1.020 μL di media T20 e 800 μL di mezzi T10.
2. Dividere il supporto T10 in due pozzetti di una piastra a quattro pozzetti, 400 μL per pozzetto. Etichettare un pozzo con "M" e il secondo pozzo con "MR". Mettere in un incubatore a CO_{2 al} 5% fino a dopo la bisezione.
3. Prep....

Discussion

I metodi precedentemente utilizzati per ridurre il numero di copie di mtDNA negli ovociti hanno i loro rispettivi svantaggi. La rimozione basata sulla micromanipolazione dei mitocondri dagli ovociti riduce il numero di copie del mtDNA in media del 64%²⁷. Un metodo unico, precedentemente utilizzato per l'enucleazione, prevede l'uso di pipette Pasteur di piccolo diametro e la scissione di un ovocita privo di zona pellucida al confine tra una microgoccia di media e l'olio minerale circostante. Insiem.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage