Uso della bisezione per ridurre il DNA mitocondriale nell'ovocita bovino

Il trasferimento nucleare di cellule somatiche interspecie (iSCNT) può essere utilizzato per salvare specie in via di estinzione, ma esistono due distinte popolazioni di DNA mitocondriale (mtDNA) all'interno dell'embrione ricostruito: una all'interno dell'ooplasma ricevente e una all'interno della cellula somatica donatrice. Questa eteroplasmia mitocondriale può portare a problemi di sviluppo nell'embrione e nel feto. I protocolli di clonazione fatti a mano includono la bisezione degli ovociti, che può essere utilizzata per ridurre il numero di copie del mtDNA, riducendo il grado di eteroplasmia mitocondriale in un embrione ricostruito. La centrifugazione di ovociti bovini maturi denudati ha prodotto una frazione densa di mitocondri visibile a un polo dell'ovocita. Le zonae pellucidae degli ovociti sono state rimosse mediante esposizione a una soluzione di pronasi. La bisezione è stata eseguita utilizzando una microlama per rimuovere la frazione mitocondriale visibile. qPCR è stato utilizzato per quantificare il mtDNA presente in campioni di DNA estratti da ovociti interi e ooplasti tagliati in due, fornendo un confronto dei numeri di copie del mtDNA prima e dopo la bisezione. I numeri di copia sono stati calcolati utilizzando i valori di soglia del ciclo, la formula della linea di regressione di una curva standard e un rapporto che includeva le rispettive dimensioni dei prodotti MTDNA PCR e dei prodotti PCR genomici. Un ovocita bovino aveva un numero medio di copie di mtDNA (deviazione standard ±) di 137.904 ± 94.768 (n = 38). Un ooplasto impoverito di mitocondri aveva un numero medio di copie di mtDNA di 8.442 ± 13.806 (n = 33). Le copie medie di mtDNA presenti in un ooplasto ricco di mitocondri erano 79.390 ± 58.526 copie di mtDNA (n = 28). Le differenze tra queste medie calcolate indicano che la centrifugazione e la successiva bisezione possono ridurre significativamente il numero di copie di mtDNA presenti nell'ooplasto impoverito di mitocondri rispetto all'ovocita originale (P < 0,0001, determinato da ANOVA unidirezionale). La riduzione del mtDNA dovrebbe diminuire il grado di eteroplasmia mitocondriale in un embrione ricostruito, favorendo eventualmente lo sviluppo embrionale e fetale standard. L'integrazione con estratto mitocondriale dalla cellula somatica donatrice può anche essere essenziale per ottenere uno sviluppo embrionale di successo.