JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

يصف هذا البروتوكول طرق إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي ، والتطهير ، ووضع العلامات المناعية لأدمغة الفئران السليمة باستخدام iDISCO + ، متبوعا بوصف تفصيلي للتصوير باستخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية ، والتحليلات النهائية باستخدام NuMorph.

تتيح إزالة الأنسجة متبوعة بالفحص المجهري للصفائح الضوئية (LSFM) التصوير الخلوي الدقيق لبنية الدماغ السليمة ، مما يسمح بالتحليل الكمي للتغيرات الهيكلية الناجمة عن الاضطرابات الجينية أو البيئية. ينتج عن تصوير الدماغ بالكامل تقدير كمي أكثر دقة للخلايا ودراسة الاختلافات الخاصة بالمنطقة التي قد يتم تفويتها باستخدام الفحص المجهري الشائع الاستخدام للأنسجة المقسمة جسديا. إن استخدام الفحص المجهري للورقة الضوئية لتصوير الأدمغة التي تم تطهيرها يزيد بشكل كبير من سرعة الاكتساب مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر. على الرغم من أن هذه الصور تنتج كميات كبيرة جدا من البيانات الهيكلية للدماغ ، إلا أن معظم الأدوات الحسابية التي تؤدي ميزة القياس الكمي في صور الأنسجة التي تم تطهيرها تقتصر على حساب مجموعات الخلايا المتناثرة ، بدلا من جميع النوى.

هنا ، نوضح NuMorph (قياس التشكل القائم على النواة) ، وهي مجموعة من أدوات التحليل ، لتحديد جميع النوى والعلامات النووية داخل المناطق المشروحة لدماغ فأر ما بعد الولادة في اليوم الرابع (P4) بعد التطهير والتصوير على مجهر ورقة ضوئية. نحن نصف التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لقياس حجم الدماغ قبل الانكماش الناجم عن خطوات الجفاف لإزالة الأنسجة ، وتطهير الأنسجة باستخدام طريقة iDISCO + ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية ، متبوعا بالفحص المجهري للورقة الضوئية باستخدام منصة متاحة تجاريا لتصوير أدمغة الفئران بدقة خلوية. ثم نوضح خط أنابيب تحليل الصور هذا باستخدام NuMorph ، والذي يستخدم لتصحيح اختلافات الكثافة ، ودمج مربعات الصور ، ومحاذاة قنوات متعددة ، وعد النوى ، والتعليق على مناطق الدماغ من خلال التسجيل في الأطالس المتاحة للجمهور.

لقد صممنا هذا النهج باستخدام البروتوكولات والبرامج المتاحة للجمهور ، مما يسمح لأي باحث لديه المجهر والموارد الحسابية اللازمة لأداء هذه التقنيات. تسمح أدوات إزالة الأنسجة والتصوير والحساب هذه بقياس وقياس التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) لأنواع الخلايا في القشرة ويجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أي تصميم لدراسة الفئران من النوع البري / بالضربة القاضية.

يعد تصوير الدماغ بالكامل بدقة خلية واحدة تحديا مهما في علم الأعصاب. تسمح صور الدماغ ذات الدقة الخلوية بإجراء تحليل مفصل ورسم خرائط على مستوى النظام لدوائر الدماغ وكيف تتعطل هذه الدوائر بسبب عوامل الخطر الوراثية أو البيئية للاضطرابات العصبية والنفسية ، والسلوك الخلوي في الأجنة النامية ، وكذلك الدوائر العصبية في الدماغ البالغ1،2،3. هناك العديد من الأساليب النسيجية التي تسمح لصور عالية الدقة من الدماغ 3D إعادة بنائها. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات معدات متخصصة باهظة الثمن ، وقد لا تكون متوافقة مع وضع العلامات المناعية ، وقد تؤدي الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) لبعض الطرق إلى تلف الأن....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم استخدام جميع الفئران وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل.

1. تشريح الماوس والتروية

ملاحظة: تم إجراء التشريح التالي على الفئران P4 و P14 باستخدام حقنة. يختلف حجم سائل التروية حس.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نظرا لأن بروتوكول iDISCO + يقدم انكماشا كبيرا في الأنسجة ، والذي يمكن ملاحظته بسهولة بالعين (الشكل 2 ب) ، فقد أضفنا خطوة التصوير بالرنين المغناطيسي إلى خط الأنابيب هذا قبل إزالة الأنسجة لتحديد الانكماش الناجم عن إزالة الأنسجة. يبدأ سير العمل بإزالة الأنسجة غير المخية من صورة ا?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

طرق إزالة الأنسجة هي تقنيات مفيدة لقياس التنظيم الخلوي 3D للدماغ. هناك مجموعة من طرق إزالة الأنسجة الموصوفة في الأدبيات ، ولكل منها مزاياها وقيودها6،7،8،9. خيارات الأدوات الحسابية لتحليل أنواع الخلايا في الصور التي تم تط.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01MH121433 و R01MH118349 و R01MH120125 إلى JLS و R01NS110791 إلى GW) ومؤسسة الأمل. نشكر بابلو أرييل من مختبر خدمات الفحص المجهري لمساعدته في تصوير العينات. يتم دعم مختبر خدمات الفحص المجهري في قسم علم الأمراض والطب المخبري جزئيا من خلال منحة الدعم الأساسية لمركز السرطان P30 CA016086 إلى مركز Lineberger الشامل للسرطان بجامعة نورث كارولينا (UNC). يتم دعم نواة الفحص المجهري لعلم الأعصاب من خلال منحة P30 NS045892. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور جزئيا من قبل منحة الدعم المؤسسي لمركز نورث كارولينا للتكنولوجيا الحيوية 2016-IDG-1016.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
  26. . Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  34. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  35. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  36. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  37. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  38. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  39. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  40. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved