Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
该协议描述了使用iDISCO +对完整小鼠大脑进行磁共振成像,清除和免疫标记的方法,然后详细说明了使用光片显微镜成像和使用NuMorph的下游分析。
组织清除后进行光片显微镜(LSFM)能够对完整的大脑结构进行细胞分辨率成像,从而可以定量分析由遗传或环境扰动引起的结构变化。全脑成像可以更准确地定量细胞,并研究物理切片组织的常用显微镜可能遗漏的区域特异性差异。与共聚焦显微镜相比,使用光片显微镜对清除的大脑进行成像大大提高了采集速度。尽管这些图像产生非常大量的大脑结构数据,但大多数在清除组织图像中进行特征量化的计算工具仅限于计数稀疏的细胞群,而不是所有细胞核。
在这里,我们展示了NuMorph(基于核的形态测量),一组分析工具,用于量化出生后第4天(P4)小鼠大脑注释区域内的所有细胞核和核标记物,在光片显微镜上清除和成像。我们描述了磁共振成像(MRI),以在组织清除脱水步骤引起的收缩之前测量脑体积,使用iDISCO+方法清除组织,包括免疫标记,然后使用市售平台进行光片显微镜,以细胞分辨率对小鼠大脑进行成像。然后,我们使用NuMorph演示了这个图像分析管道,该管道用于校正强度差异,拼接图像图块,对齐多个通道,计数细胞核,并通过注册到公开可用的图谱来注释大脑区域。
我们使用公开可用的协议和软件设计了这种方法,允许任何具有必要显微镜和计算资源的研究人员执行这些技术。这些组织清除、成像和计算工具允许测量和量化皮层中细胞类型的三维 (3D) 组织,应广泛适用于任何野生型/敲除小鼠研究设计。
单细胞分辨率的全脑成像是神经科学中的一个重要挑战。细胞分辨率脑图像允许对脑回路进行详细分析和系统级映射,以及该回路如何被神经精神疾病的遗传或环境风险因素、发育中的胚胎中的细胞行为以及成人大脑中的神经回路破坏1,2,3。有多种组织学方法可以对重建的3D大脑进行高分辨率图像;然而,这些技术需要昂贵的专用设备,可能与免疫标记不兼容,并且某些方法的二维(2D)性质可能导致切片过程中的组织损伤和剪切4,5。
最近的进展提供了一种不需要组织切片的整个大脑成像的替代方法;它们涉及使用组织清除使大脑透明。在大多数组织清除方法中,通过去除脂质(因为它们是光散射的主要来源)以及在成像过程中将物体的折射率(RI)与样品浸没溶液的折射率(RI)相匹配来实现透明度。然后光可以穿过材料之间的边界而不会被散射6,7,8,9。
这项工作得到了NIH(R01MH121433,R01MH118349和R01MH120125到JLS和R01NS110791到GW)和希望基金会的支持。我们感谢显微镜服务实验室的Pablo Ariel协助样品成像。病理学和检验医学系的显微镜服务实验室得到了癌症中心核心支持拨款P30 CA016086对北卡罗来纳大学(UNC)Lineberger综合癌症中心的部分支持。神经科学显微镜核心由拨款P30 NS045892支持。本出版物中报告的研究部分得到了北卡罗来纳州生物技术中心机构支持补助金2016-IDG-1016的支持。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
EVO 860 4TB external SSD | |||
Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
ITK Snap | segmentation software | ||
Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
Antibody | Working concentration | ||
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
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