Helhjerne enkeltcellebilleddannelse og analyse af intakte neonatale musehjerner ved hjælp af MR, vævsrensning og lysarkmikroskopi

Denne protokol beskriver metoder til udførelse af magnetisk resonansbilleddannelse, rydning og immunmærkning af intakte musehjerner ved hjælp af iDISCO+, efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af billeddannelse ved hjælp af lysarkmikroskopi og nedstrømsanalyser ved hjælp af NuMorph.

Vævsrensning efterfulgt af lysarkmikroskopi (LSFM) muliggør cellulær opløsningsbilleddannelse af intakt hjernestruktur, hvilket muliggør kvantitativ analyse af strukturelle ændringer forårsaget af genetiske eller miljømæssige forstyrrelser. Helhjernebilleddannelse resulterer i mere nøjagtig kvantificering af celler og undersøgelse af regionsspecifikke forskelle, der kan gå glip af med almindeligt anvendt mikroskopi af fysisk sektioneret væv. Brug af lysarkmikroskopi til billedrensede hjerner øger anskaffelseshastigheden betydeligt sammenlignet med konfokal mikroskopi. Selvom disse billeder producerer meget store mængder hjernestrukturelle data, er de fleste beregningsværktøjer, der udfører funktionskvantificering i billeder af ryddet væv, begrænset til at tælle sparsomme cellepopulationer snarere end alle kerner.

Her demonstrerer vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en gruppe analyseværktøjer, til at kvantificere alle kerner og nukleare markører inden for kommenterede områder af en postnatal dag 4 (P4) musehjerne efter rydning og billeddannelse på et lysarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) for at måle hjernevolumen før krympning forårsaget af vævsrensningsdehydreringstrin, vævsrensning ved hjælp af iDISCO + -metoden, herunder immunmærkning, efterfulgt af lysarkmikroskopi ved hjælp af en kommercielt tilgængelig platform til at afbilde musehjerner ved cellulær opløsning. Vi demonstrerer derefter denne billedanalysepipeline ved hjælp af NuMorph, som bruges til at korrigere intensitetsforskelle, sy billedfliser, justere flere kanaler, tælle kerner og kommentere hjerneområder gennem registrering til offentligt tilgængelige atlasser.

Vi designede denne tilgang ved hjælp af offentligt tilgængelige protokoller og software, så enhver forsker med de nødvendige mikroskop- og beregningsressourcer kan udføre disse teknikker. Disse vævsrensnings-, billeddannelses- og beregningsværktøjer muliggør måling og kvantificering af den tredimensionelle (3D) organisering af celletyper i cortex og bør være bredt anvendelig til ethvert vildtype / knockout-museundersøgelsesdesign.

Helhjernebilleddannelse ved enkeltcelleopløsning er en vigtig udfordring inden for neurovidenskab. Hjernebilleder i cellulær opløsning giver mulighed for detaljeret analyse og kortlægning på systemniveau af hjernekredsløb, og hvordan dette kredsløb forstyrres af genetiske eller miljømæssige risikofaktorer for neuropsykiatriske lidelser, cellulær adfærd ved udvikling af embryoner samt neurale kredsløb i den voksne hjerne ^1,2,3. Der er flere histologiske metoder, der giver mulighed for billeder i høj opløsning af den rekonstruerede 3D-hjerne; disse teknikker kræver imidlertid d....

Alle mus blev brugt i overensstemmelse med og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill.

1. Musedissektion og perfusion

BEMÆRK: Følgende dissektioner blev udført på P4- og P14-mus ved hjælp af en sprøjte. Volumenet af perfusionsvæske vil variere afhængigt af dyrets alder.

1. Perfusion
   FORSIGTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farligt kemikalie. Udfør alle perfusions.......

Da iDISCO+ protokollen introducerer signifikant vævskrympning, som let kan mærkes af øjet (figur 2B), tilføjede vi et MR-trin til denne rørledning før vævsrensning for at kvantificere krympningen induceret af vævsrensning. Arbejdsgangen starter med fjernelse af ikke-hjernevævet fra MR-billedet (figur 2C). Derefter anvendes en stiv transformation (3 oversættelses- og 3 rotationsvinkler) for at justere MR-billedet til lysarkbilledet (

Vævsrensningsmetoder er nyttige teknikker til måling af 3D-cellulær organisering af hjernen. Der er et væld af vævsrensningsmetoder beskrevet i litteraturen, hver med sine fordele og begrænsninger 6,7,8,9. Mulighederne for beregningsværktøjer til at analysere celletyperne i de vævsryddede billeder er relativt begrænsede. Andre tilgængelige værktøjer er blevet implementeret til spar.......

Dette arbejde blev støttet af NIH (R01MH121433, R01MH118349 og R01MH120125 til JLS og R01NS110791 til GW) og Foundation of Hope. Vi takker Pablo Ariel fra Microscopy Services Laboratory for at hjælpe med prøvebilleddannelse. Microscopy Services Laboratory i Institut for Patologi og Laboratoriemedicin støttes delvist af Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 til University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core er støttet af bevilling P30 NS045892. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.