JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Weefselopruiming gevolgd door light-sheet microscopie (LSFM) maakt beeldvorming met cellulaire resolutie van intacte hersenstructuur mogelijk, waardoor kwantitatieve analyse van structurele veranderingen veroorzaakt door genetische of omgevingsverstoringen mogelijk is. Beeldvorming van de hele hersenen resulteert in een nauwkeurigere kwantificering van cellen en de studie van regiospecifieke verschillen die kunnen worden gemist met veelgebruikte microscopie van fysiek gesneden weefsel. Het gebruik van light-sheet microscopie om gewiste hersenen in beeld te brengen, verhoogt de acquisitiesnelheid aanzienlijk in vergelijking met confocale microscopie. Hoewel deze beelden zeer grote hoeveelheden structurele hersengegevens produceren, zijn de meeste computationele hulpmiddelen die functiekwantificering uitvoeren in afbeeldingen van gewist weefsel beperkt tot het tellen van schaarse celpopulaties, in plaats van alle kernen.

Hier demonstreren we NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), een groep analysetools, om alle kernen en nucleaire markers te kwantificeren binnen geannoteerde gebieden van een postnatale dag 4 (P4) muizenhersen na clearing en beeldvorming op een light-sheet microscoop. We beschrijven magnetische resonantie beeldvorming (MRI) om het hersenvolume te meten voorafgaand aan krimp veroorzaakt door uitdrogingsstappen van weefsel, weefsel opruimen met behulp van de iDISCO + -methode, inclusief immunolabeling, gevolgd door light-sheet microscopie met behulp van een commercieel beschikbaar platform om muizenhersenen met cellulaire resolutie in beeld te brengen. Vervolgens demonstreren we deze pijplijn voor beeldanalyse met Behulp van NuMorph, dat wordt gebruikt om intensiteitsverschillen te corrigeren, beeldtegels te naaien, meerdere kanalen uit te lijnen, kernen te tellen en hersengebieden te annoteren door registratie op openbaar beschikbare atlassen.

We hebben deze aanpak ontworpen met behulp van openbaar beschikbare protocollen en software, waardoor elke onderzoeker met de nodige microscoop en computationele middelen deze technieken kan uitvoeren. Deze weefselopruimings-, beeldvormings- en computationele hulpmiddelen maken het mogelijk om de driedimensionale (3D) organisatie van celtypen in de cortex te meten en kwantificeren en zouden op grote schaal toepasbaar moeten zijn op elk wild-type / knock-out muisstudieontwerp.

Beeldvorming van de hele hersenen met eencellige resolutie is een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Hersenbeelden met cellulaire resolutie maken gedetailleerde analyse en het in kaart brengen op systeemniveau van hersencircuits mogelijk en hoe die circuits worden verstoord door genetische of omgevingsrisicofactoren voor neuropsychiatrische aandoeningen, cellulair gedrag bij het ontwikkelen van embryo's, evenals neurale circuits in de volwassen hersenen 1,2,3. Er zijn meerdere histologische methoden die beelden met hoge resolutie van het gereconstrueerde 3D-brein....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle muizen werden gebruikt in overeenstemming met en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.

1. Muisdissectie en perfusie

OPMERKING: De volgende dissecties werden uitgevoerd op P4- en P14-muizen met behulp van een spuit. Het volume perfusievloeistof zal variëren afhankelijk van de leeftijd van het dier.

  1. Perfusie
    LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is een.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Omdat het iDISCO+ protocol aanzienlijke weefselkrimp introduceert, die gemakkelijk merkbaar is door het oog (figuur 2B), hebben we een MRI-stap aan deze pijplijn toegevoegd voorafgaand aan het opruimen van weefsel om de krimp te kwantificeren die wordt veroorzaakt door weefselopruiming. De workflow begint met het verwijderen van het niet-hersenweefsel uit het MR-beeld (figuur 2C). Vervolgens wordt een rigide transformatie (3 translatie- en 3 rotatiehoeken) toege.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Weefselopruimingsmethoden zijn nuttige technieken voor het meten van 3D cellulaire organisatie van de hersenen. Er zijn een groot aantal weefselzuiveringsmethoden beschreven in de literatuur, elk met zijn voordelen en beperkingen 6,7,8,9. De opties voor computationele hulpmiddelen om de celtypen in de weefsel-gewiste beelden te analyseren zijn relatief beperkt. Andere beschikbare hulpmiddelen z.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01MH121433, R01MH118349 en R01MH120125 voor JLS en R01NS110791 voor GW) en de Foundation of Hope. We bedanken Pablo Ariel van het Microscopy Services Laboratory voor zijn hulp bij het afbeelden van monsters. Het Microscopy Services Laboratory in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde wordt gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 aan het Lineberger Comprehensive Cancer Center van de University of North Carolina (UNC). De Neuroscience Microscopy Core wordt ondersteund door subsidie P30 NS045892. Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd gedeeltelijk ondersteund door d....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
  26. . Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  34. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  35. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  36. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  37. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  38. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  39. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  40. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved