Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.

Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.

Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.

L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte ^1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des....

Toutes les souris ont été utilisées conformément et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Dissection et perfusion de souris

NOTE: Les dissections suivantes ont été effectuées sur des souris P4 et P14 à l’aide d’une seringue. Le volume de liquide de perfusion variera en fonction de l’âge de l’animal.

1. Perfusion
   ATTENTION : Le paraf.......

Comme le protocole iDISCO+ introduit un rétrécissement tissulaire important, facilement perceptible à l’œil nu (Figure 2B), nous avons ajouté une étape IRM à ce pipeline avant le nettoyage tissulaire pour quantifier le rétrécissement induit par le nettoyage des tissus. Le flux de travail commence par le retrait du tissu non cérébral de l’image IRM (Figure 2C). Ensuite, une transformation rigide (3 angles de translation et 3 angles de rotation) est.......

Les méthodes de nettoyage des tissus sont des techniques utiles pour mesurer l’organisation cellulaire 3D du cerveau. Il existe une foule de méthodes de nettoyage des tissus décrites dans la littérature, chacune avec ses avantages et ses limites 6,7,8,9. Les options d’outils informatiques pour analyser les types de cellules dans les images effacées des tissus sont relativement limitée.......

Ce travail a été soutenu par le NIH (R01MH121433, R01MH118349 et R01MH120125 à JLS et R01NS110791 à GW) et la Fondation de l’espoir. Nous remercions Pablo Ariel, du Laboratoire des services de microscopie, de son aide dans l’imagerie des échantillons. Le laboratoire des services de microscopie du département de pathologie et de médecine de laboratoire est soutenu en partie par la subvention P30 CA016086 du Cancer Center Core Support à l’Université de Caroline du Nord (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Le noyau de microscopie en neurosciences est soutenu par la subvention P30 NS045892. La recherche rapportée dans cette publication a été financée en partie pa....