Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung von Magnetresonanztomographie, Clearing und Immunmarkierung intakter Mausgehirne mit iDISCO+, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Bildgebung mittels Lichtblattmikroskopie und nachgeschalteten Analysen mit NuMorph.

Die Gewebereinigung gefolgt von Lichtblattmikroskopie (LSFM) ermöglicht die zelluläre Bildgebung intakter Gehirnstrukturen und ermöglicht eine quantitative Analyse struktureller Veränderungen, die durch genetische oder Umweltstörungen verursacht werden. Die Ganzhirnbildgebung führt zu einer genaueren Quantifizierung von Zellen und zur Untersuchung regionsspezifischer Unterschiede, die bei häufig verwendeter Mikroskopie von physisch geschnittenem Gewebe übersehen werden können. Die Verwendung von Lichtblattmikroskopie zur Abbildung geklärter Gehirne erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie erheblich. Obwohl diese Bilder sehr große Mengen an Gehirnstrukturdaten produzieren, sind die meisten Computerwerkzeuge, die eine Merkmalsquantifizierung in Bildern von geklärtem Gewebe durchführen, darauf beschränkt, spärliche Zellpopulationen und nicht alle Kerne zu zählen.

Hier demonstrieren wir NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), eine Gruppe von Analysewerkzeugen, um alle Kerne und Kernmarker in annotierten Regionen eines postnatalen Day 4 (P4) Mausgehirns nach der Klärung und Bildgebung auf einem Lichtblattmikroskop zu quantifizieren. Wir beschreiben Magnetresonanztomographie (MRT) zur Messung des Gehirnvolumens vor der Schrumpfung durch Dehydratationsschritte zur Gewebereinigung, Gewebereinigung mit der iDISCO+-Methode, einschließlich Immunmarkierung, gefolgt von Lichtblattmikroskopie mit einer kommerziell erhältlichen Plattform zur Abbildung von Mäusegehirnen mit zellulärer Auflösung. Anschließend demonstrieren wir diese Bildanalyse-Pipeline mit NuMorph, die verwendet wird, um Intensitätsunterschiede zu korrigieren, Bildkacheln zu nähen, mehrere Kanäle auszurichten, Kerne zu zählen und Gehirnregionen durch Registrierung in öffentlich verfügbaren Atlanten zu kommentieren.

Wir haben diesen Ansatz unter Verwendung öffentlich verfügbarer Protokolle und Software entwickelt, so dass jeder Forscher mit den erforderlichen Mikroskop- und Rechenressourcen diese Techniken durchführen kann. Diese Gewebereinigungs-, Bildgebungs- und Computerwerkzeuge ermöglichen die Messung und Quantifizierung der dreidimensionalen (3D) Organisation von Zelltypen im Kortex und sollten für jedes Wildtyp- / Knockout-Mausstudiendesign allgemein anwendbar sein.

Die Bildgebung des gesamten Gehirns mit Einzelzellauflösung ist eine wichtige Herausforderung in den Neurowissenschaften. Gehirnbilder mit zellularer Auflösung ermöglichen eine detaillierte Analyse und Kartierung von Gehirnschaltkreisen auf Systemebene und wie diese Schaltkreise durch genetische oder umweltbedingte Risikofaktoren für neuropsychiatrische Störungen, zelluläres Verhalten bei sich entwickelnden Embryonen sowie neuronale Schaltkreise im erwachsenen Gehirn gestört werden ^1,2,3. Es gibt mehrere histologische Methoden, die hochauflösende Bilder des rekonstruierten 3D....

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill verwendet und von diesem genehmigt.

1. Mausdissektion und Durchblutung

HINWEIS: Die folgenden Dissektionen wurden an P4- und P14-Mäusen mit einer Spritze durchgeführt. Das Volumen der Perfusionsflüssigkeit variiert je nach Alter des Tieres.

1. Perfusion
   ACHTUNG: Paraformaldehyd (PFA) ist e.......

Da das iDISCO+-Protokoll eine signifikante Gewebeschrumpfung einführt, die mit dem Auge leicht wahrnehmbar ist (Abbildung 2B), haben wir dieser Pipeline vor der Gewebereinigung einen MRT-Schritt hinzugefügt, um die durch die Gewebereinigung induzierte Schrumpfung zu quantifizieren. Der Workflow beginnt mit der Entfernung des Nicht-Hirngewebes aus dem MR-Bild (Abbildung 2C). Als nächstes wird eine starre Transformation (3 Translations- und 3 Drehwinkel) angewe.......

Gewebereinigungsmethoden sind nützliche Techniken zur Messung der 3D-Zellorganisation des Gehirns. Es gibt eine Vielzahl von Gewebereinigungsmethoden, die in der Literatur beschrieben sind, jede mit ihren Vorteilen und Einschränkungen 6,7,8,9. Die Möglichkeiten für Computerwerkzeuge zur Analyse der Zelltypen in den gewebebereinigten Bildern sind relativ begrenzt. Andere verfügbare Werkzeug.......

Diese Arbeit wurde vom NIH (R01MH121433, R01MH118349 und R01MH120125 an JLS und R01NS110791 an GW) und der Foundation of Hope unterstützt. Wir danken Pablo Ariel vom Microscopy Services Laboratory für die Unterstützung bei der Probenbildgebung. Das Microscopy Services Laboratory in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin wird teilweise durch den Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 an das Lineberger Comprehensive Cancer Center der University of North Carolina (UNC) unterstützt. Der Neuroscience Microscopy Core wird durch den Zuschuss P30 NS045892 unterstützt. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde teilweise durch den North Carolina Biotech....