JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

ניקוי רקמות ואחריו מיקרוסקופיה של יריעות אור (LSFM) מאפשרים הדמיה ברזולוציה תאית של מבנה מוח שלם, ומאפשרים ניתוח כמותי של שינויים מבניים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או סביבתיות. הדמיה של מוח שלם מביאה לכימות מדויק יותר של תאים ולחקר הבדלים ספציפיים לאזור שעלולים להתפספס במיקרוסקופיה נפוצה של רקמות שנחתכו פיזית. שימוש במיקרוסקופיה של יריעות אור כדי לצלם מוחות מנוקים מגביר מאוד את מהירות הרכישה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אף על פי שתמונות אלה מייצרות כמויות גדולות מאוד של נתונים מבניים על המוח, רוב הכלים החישוביים המבצעים כימות תכונות בתמונות של רקמות מנוקות מוגבלים לספירת אוכלוסיות תאים דלילות, ולא לכל הגרעינים.

כאן אנו מדגימים את NuMorph (מורפומטריה מבוססת גרעין), קבוצה של כלי ניתוח, כדי לכמת את כל הגרעינים והסמנים הגרעיניים באזורים מבוארים במוח עכבר ביום 4 (P4) לאחר הלידה לאחר ניקוי והדמיה במיקרוסקופ של יריעת אור. אנו מתארים דימות תהודה מגנטית (MRI) למדידת נפח המוח לפני התכווצות הנגרמת על ידי שלבי התייבשות של ניקוי רקמות, ניקוי רקמות בשיטת iDISCO+, כולל תיוג חיסוני, ולאחר מכן מיקרוסקופיה של יריעות אור באמצעות פלטפורמה זמינה מסחרית לצילום מוחות עכברים ברזולוציה תאית. לאחר מכן אנו מדגימים את צינור ניתוח התמונות הזה באמצעות NuMorph, המשמש לתיקון הבדלי עוצמה, לתפירת אריחי תמונה, יישור ערוצים מרובים, ספירת גרעינים וביאור אזורי מוח באמצעות רישום לאטלסים הזמינים לציבור.

עיצבנו גישה זו תוך שימוש בפרוטוקולים ובתוכנות הזמינים לציבור, ומאפשרים לכל חוקר בעל המיקרוסקופ והמשאבים החישוביים הדרושים לבצע טכניקות אלה. כלים אלה של ניקוי רקמות, הדמיה וחישוב מאפשרים מדידה וכימות של הארגון התלת-ממדי (3D) של סוגי תאים בקליפת המוח, והם אמורים להיות ישימים באופן נרחב לכל תכנון מחקר של עכברי בר/נוקאאוט.

דימות מוחי שלם ברזולוציה של תא בודד הוא אתגר חשוב במדעי המוח. תמונות מוח ברזולוציה תאית מאפשרות ניתוח מפורט ומיפוי ברמת המערכת של מעגלי המוח וכיצד מעגלים אלה מופרעים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים להפרעות נוירופסיכיאטריות, התנהגות תאית בעוברים מתפתחים, כמו גם מעגלים עצביים במוח הבוגר 1,2,3. ישנן שיטות היסטולוגיות מרובות המאפשרות תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח התלת-ממדי המשוחזר; עם זאת, טכניקות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, ייתכן שאינן תואמות את התווית החיסונית, והאופי הדו-ממדי (2D) של שיטות מסוימות עלול להוביל לנזק לרקמות ולגזירה במהלך חתך 4,....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל העכברים שימשו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. דיסקציה של עכבר וזלוף

הערה: הניתוחים הבאים בוצעו בעכברי P4 ו-P14 באמצעות מזרק. נפח נוזל הזלוף ישתנה בהתאם לגיל החיה.

  1. פרפוזיה

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מכיוון שפרוטוקול iDISCO+ מציג התכווצות משמעותית של רקמות, שניתן להבחין בה בקלות בעין (איור 2B), הוספנו שלב MRI לצינור זה לפני פינוי הרקמות כדי לכמת את ההתכווצות הנגרמת על-ידי ניקוי רקמות. תהליך העבודה מתחיל בהסרת הרקמה שאינה במוח מתמונת ה-MR (איור 2C). לאחר מכן, טרנספ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטות ניקוי רקמות הן טכניקות שימושיות למדידת ארגון תאי תלת-ממדי של המוח. ישנן שורה של שיטות ניקוי רקמות המתוארות בספרות, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה 6,7,8,9. האפשרויות לכלים חישוביים לניתוח סוגי התאים בתמונות המנוקות ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (R01MH121433, R01MH118349 ו-R01MH120125 ל-JLS ו-R01NS110791 ל-GW) וקרן התקווה. אנו מודים לפבלו אריאל מהמעבדה לשירותי מיקרוסקופיה על הסיוע בהדמיית דגימות. המעבדה לשירותי מיקרוסקופיה במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית נתמכת בחלקה על ידי מענק התמיכה המרכזי של מרכז הסרטן P30 CA016086 למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת צפון קרוליינה (UNC) ליינברגר. ליבת המיקרוסקופיה של מדעי המוח נתמכת על ידי מענק P30 NS045892. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך בחלקו על ידי מענק התמיכה המוסדית של מרכז הביוטק של צפון קרוליינה 2016-IDG-1016.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
  26. . Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  34. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  35. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  36. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  37. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  38. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  39. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  40. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved