एमआरआई, ऊतक समाशोधन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका इमेजिंग और बरकरार नवजात माउस दिमाग का विश्लेषण

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

Felix A. Kyere^1,2*, Ian Curtin^1,2*, Oleh Krupa^1,2, Carolyn M. McCormick^1,2, Mustafa Dere³, Sarah Khan^3,7, Minjeong Kim⁷, Tzu-Wen Winnie Wang^4,5,6, Qiuhong He^4,5,6, Guorong Wu³, Yen-Yu Ian Shih^4,5,6, Jason L. Stein^1,2

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

यह प्रोटोकॉल आईडीआईएससीओ + का उपयोग करके बरकरार माउस दिमाग के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग के संचालन के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेजिंग का विस्तृत विवरण और न्यूमोर्फ का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करता है।

लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के बाद ऊतक समाशोधन बरकरार मस्तिष्क संरचना के सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे आनुवंशिक या पर्यावरणीय गड़बड़ी के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है। पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की अधिक सटीक मात्रा और क्षेत्र-विशिष्ट मतभेदों का अध्ययन होता है जो शारीरिक रूप से विभाजित ऊतक के आमतौर पर उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी के साथ याद किया जा सकता है। साफ़ किए गए दिमाग की छवि के लिए लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिग्रहण की गति बहुत बढ़ जाती है। यद्यपि ये छवियां बहुत बड़ी मात्रा में मस्तिष्क संरचनात्मक डेटा का उत्पादन करती हैं, अधिकांश कम्प्यूटेशनल उपकरण जो साफ ऊतक की छवियों में सुविधा परिमाणीकरण करते हैं, सभी नाभिकों के बजाय विरल सेल आबादी की गिनती तक सीमित हैं।

यहां, हम न्यूमोर्फ (परमाणु-आधारित मॉर्फोमेट्री), विश्लेषण उपकरणों का एक समूह प्रदर्शित करते हैं, जो एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर समाशोधन और इमेजिंग के बाद प्रसवोत्तर दिन 4 (पी 4) माउस मस्तिष्क के एनोटेट क्षेत्रों के भीतर सभी नाभिक और परमाणु मार्करों को निर्धारित करने के लिए है। हम चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का वर्णन ऊतक समाशोधन निर्जलीकरण चरणों के कारण होने वाले संकोचन से पहले मस्तिष्क की मात्रा को मापने के लिए करते हैं, इम्यूनोलेबलिंग सहित आईडीआईएससीओ + विधि का उपयोग करके ऊतक समाशोधन, इसके बाद सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर माउस दिमाग की छवि बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच का उपयोग करके लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। फिर हम न्यूमोर्फ का उपयोग करके इस छवि विश्लेषण पाइपलाइन का प्रदर्शन करते हैं, जिसका उपयोग तीव्रता अंतर को ठीक करने, छवि टाइलों को सिलाई करने, कई चैनलों को संरेखित करने, नाभिक की गणना करने और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एटलस में पंजीकरण के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों को एनोटेट करने के लिए किया जाता है।

हमने सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस दृष्टिकोण को डिजाइन किया, जिससे किसी भी शोधकर्ता को इन तकनीकों को करने के लिए आवश्यक माइक्रोस्कोप और कम्प्यूटेशनल संसाधनों की अनुमति मिली। ये ऊतक समाशोधन, इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल उपकरण कॉर्टेक्स में सेल-प्रकारों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन के माप और परिमाणीकरण की अनुमति देते हैं और किसी भी जंगली-प्रकार / नॉकआउट माउस अध्ययन डिजाइन पर व्यापक रूप से लागू होना चाहिए।

एकल-कोशिका संकल्प पर पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क छवियां मस्तिष्क सर्किटरी के विस्तृत विश्लेषण और सिस्टम-स्तरीय मानचित्रण की अनुमति देती हैं और न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों, विकासशील भ्रूण में सेलुलर व्यवहार, साथ ही वयस्क मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट के लिए आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोखिम कारकों द्वारा सर्किटरी^कैसे बाधित होती ^है। कई हिस्टोलॉजिकल विधियां हैं जो पुनर्निर्मित 3 डी मस्तिष्क की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की अनुमति देती हैं; हालांकि, इन तकनीकों को महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, इम्यूनोलेबलिंग के स....

सभी चूहों का उपयोग चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार और अनुमोदित किया गया था।

1. माउस विच्छेदन और छिड़काव

जैसा कि आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण ऊतक संकोचन का परिचय देता है, जो आंखों द्वारा आसानी से ध्यान देने योग्य है (चित्रा 2 बी), हमने ऊतक समाशोधन से प्रेरित संकोचन को निर्धारित करने के लिए ?.......

ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क के 3 डी सेलुलर संगठन को मापने के लिए उपयोगी तकनीकें हैं। साहित्य में वर्णित ऊतक समाशोधन विधियों की एक मेजबानी है, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और सीमाएं 6,7,8,9 हैं?.......

इस काम को एनआईएच (R01MH121433, R01MH118349, और R01MH120125 से JLS और R01NS110791 से GW) और फाउंडेशन ऑफ होप द्वारा समर्थित किया गया था। हम नमूना इमेजिंग में सहायता के लिए माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला के पाब्लो एरियल को धन्यवाद देते हैं। पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग में माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय (यूएनसी) लाइनबर्गर कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट पी 30 सीए 016086 द्वारा समर्थित है। न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर अनुदान पी 30 एनएस 045892 द्वारा समर्थित है। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को उत्तरी कैरोलिना बायोटेक सेंटर इंस्टीट्यूशनल सपोर्ट ग्रांट 2016-आईडीजी -1016 द्वारा समर्थित किया गया था।

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H₂O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H₂O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H₂O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)

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