Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l'analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L'imaging dell'intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L'uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all'interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l'imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l'immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell'immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell'organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

L'imaging dell'intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un'analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto ^1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; t....

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill.

1. Dissezione e perfusione del topo

NOTA: Le seguenti dissezioni sono state eseguite su topi P4 e P14 utilizzando una siringa. Il volume del liquido di perfusione varierà a seconda dell'età dell'animale.

1. Perfusione
   ATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una .......

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall'immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida .......

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l'organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono .......

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 a JLS e R01NS110791 a GW) e dalla Foundation of Hope. Ringraziamo Pablo Ariel del Laboratorio Servizi di Microscopia per l'assistenza nell'imaging dei campioni. Il Laboratorio di Servizi di Microscopia presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio è supportato in parte dal Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 al Lineberger Comprehensive Cancer Center dell'Università della Carolina del Nord (UNC). Il nucleo di microscopia neuroscientifica è supportato dalla sovvenzione P30 NS045892. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata in parte dal North C....