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Neuroscience

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

조직 투명화 후 라이트 시트 현미경(LSFM)을 통해 온전한 뇌 구조의 세포 분해능 이미징이 가능하여 유전적 또는 환경적 섭동으로 인한 구조적 변화를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 전뇌 영상은 세포의 보다 정확한 정량화와 물리적으로 절단된 조직의 일반적으로 사용되는 현미경으로는 놓칠 수 있는 영역별 차이에 대한 연구를 가능하게 합니다. 라이트 시트 현미경을 사용하여 맑은 뇌를 이미지화하면 컨포칼 현미경에 비해 획득 속도가 크게 향상됩니다. 이러한 이미지는 매우 많은 양의 뇌 구조 데이터를 생성하지만 제거 된 조직의 이미지에서 특징 정량화를 수행하는 대부분의 계산 도구는 모든 핵이 아닌 희소 세포 집단을 계산하는 것으로 제한됩니다.

여기에서는 분석 도구 그룹인 NuMorph(핵 기반 형태 측정법)를 시연하여 라이트 시트 현미경으로 투명화 및 이미징한 후 출생 후 4일차(P4) 마우스 뇌의 주석이 달린 영역 내의 모든 핵과 핵 마커를 정량화합니다. 조직 제거 탈수 단계로 인한 수축 전에 뇌 부피를 측정하는 자기 공명 영상 (MRI), 면역 표지를 포함한 iDISCO + 방법을 사용한 조직 청소, 상용 플랫폼을 사용하여 세포 해상도로 마우스 뇌를 이미지화하는 라이트 시트 현미경에 대해 설명합니다. 그런 다음 강도 차이를 수정하고, 이미지 타일을 연결하고, 여러 채널을 정렬하고, 핵을 계산하고, 공개적으로 사용 가능한 지도책에 등록을 통해 뇌 영역에 주석을 추가하는 데 사용되는 NuMorph를 사용하여 이 이미지 분석 파이프라인을 시연합니다.

우리는 공개적으로 사용 가능한 프로토콜과 소프트웨어를 사용하여 이 접근 방식을 설계하여 필요한 현미경과 계산 리소스를 가진 모든 연구원이 이러한 기술을 수행할 수 있도록 했습니다. 이러한 조직 청소, 이미징 및 계산 도구를 사용하면 피질에서 세포 유형의 3차원(3D) 조직을 측정하고 정량화할 수 있으며 모든 야생형/녹아웃 마우스 연구 설계에 널리 적용할 수 있어야 합니다.

단일 세포 분해능의 전체 뇌 영상은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 세포 해상도 뇌 이미지는 뇌 회로에 대한 상세한 분석 및 시스템 수준 매핑과 신경 정신 장애에 대한 유전 적 또는 환경 적 위험 요소, 발달중인 배아의 세포 행동 및 성인 뇌의 신경 회로 1,2,3에 의해 회로가 어떻게 파괴되는지를 허용합니다. 재구성 된 3D 뇌의 고해상도 이미지를 허용하는 여러 조직 학적 방법이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 값 비싸고 전문화 된 장비가 필요하며 면역 표지와 호환되지 않을 수 있으며 일부 방법의 2 차원 (2D) 특성으로 인해 절편 4,5 동안 조직 손상 및 전단이 발생할 수 있습니다.

최근의 발전은 조직 절편이 필요하지 않은 전체 뇌를 영상화하는 대안적인 접근 방식을 제공했습니다. 그들은 뇌를 투명하게 만들기 위해 조직 청소를 사용하는 것을 포함합니다. 대부분의 조직 투명화 방법에서 지질은 광산란의 주요 원인이기 때문에 지질을 제거하고 이미징 중에 물체의 굴절률(RI....

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모든 마우스는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 승인되었습니다.

1. 마우스 해부 및 관류

참고: 다음 해부는 주사기를 사용하여 P4 및 P14 마우스에서 수행되었습니다. 관류액의 양은 동물의 나이에 따라 다릅니다.

  1. 관류
    주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA)는 위험한 화학 물질입?.......

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iDISCO+ 프로토콜은 눈으로 쉽게 알아볼 수 있는 상당한 조직 수축을 도입하므로(그림 2B), 조직 투명화로 인한 수축을 정량화하기 위해 조직 제거 전에 이 파이프라인에 MRI 단계를 추가했습니다. 워크플로우는 MR 이미지에서 뇌가 아닌 조직을 제거하는 것으로 시작됩니다(그림 2C). 다음으로, 강체 변환(3개의 평행 이동 및 3개의 회전 각도)을 적용하여 MR ?.......

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조직 제거 방법은 뇌의 3D 세포 조직을 측정하는 데 유용한 기술입니다. 문헌에 기술된 다수의 조직 투명화 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계가 있다 6,7,8,9. 조직 투명 이미지에서 세포 유형을 분석하기 위한 계산 도구에 대한 옵션은 상대적으로 제한적입니다. 다른 이용가능한 도구들은 분할이 덜 ?.......

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이 작업은 NIH (R01MH121433, R01MH118349 및 R01MH120125에서 JLS로, R01NS110791에서 GW로)와 희망의 재단에 의해 지원되었습니다. 샘플 이미징을 지원해 주신 현미경 서비스 연구소의 Pablo Ariel에게 감사드립니다. 병리학 및 실험실 의학과의 현미경 서비스 실험실은 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC) Lineberger 종합 암 센터에 대한 암 센터 핵심 지원 보조금 P30 CA016086에 의해 부분적으로 지원됩니다. 신경 과학 현미경 코어는 보조금 P30 NS045892에 의해 지원됩니다. 이 간행물에보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 생명 공학 센터 기관 지원 보조금 2016-IDG-1016에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

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