Helhjerne enkeltcelleavbildning og analyse av intakte neonatale musehjerner ved bruk av MR, vevsrydding og lysarkmikroskopi

Denne protokollen beskriver metoder for å utføre magnetisk resonansavbildning, clearing og immunolabeling av intakte musehjerner ved hjelp av iDISCO +, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av avbildning ved hjelp av lysarkmikroskopi og nedstrømsanalyser ved hjelp av NuMorph.

Vevsrydding etterfulgt av lysarkmikroskopi (LSFM) muliggjør cellulær oppløsningsavbildning av intakt hjernestruktur, noe som muliggjør kvantitativ analyse av strukturelle endringer forårsaket av genetiske eller miljømessige forstyrrelser. Helhjerneavbildning resulterer i mer nøyaktig kvantifisering av celler og studiet av regionspesifikke forskjeller som kan bli savnet med vanlig mikroskopi av fysisk seksjonert vev. Bruk av lysarkmikroskopi til bildeklarerte hjerner øker anskaffelseshastigheten betydelig sammenlignet med konfokalmikroskopi. Selv om disse bildene produserer svært store mengder hjernestrukturdata, er de fleste beregningsverktøy som utfører funksjonskvantifisering i bilder av ryddet vev, begrenset til å telle sparsomme cellepopulasjoner, i stedet for alle kjerner.

Her demonstrerer vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en gruppe analyseverktøy, for å kvantifisere alle kjerner og nukleære markører innenfor kommenterte regioner i en postnatal dag 4 (P4) musehjerne etter rydding og avbildning på et lysarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonansavbildning (MRI) for å måle hjernevolum før krymping forårsaket av vevsrydding dehydreringstrinn, vevsrydding ved hjelp av iDISCO + -metoden, inkludert immunmerking, etterfulgt av lysarkmikroskopi ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig plattform for å avbilde musehjerner ved cellulær oppløsning. Vi demonstrerer deretter denne bildeanalysepipelinen ved hjelp av NuMorph, som brukes til å korrigere intensitetsforskjeller, sy bildefliser, justere flere kanaler, telle kjerner og kommentere hjernegrupper gjennom registrering til offentlig tilgjengelige atlas.

Vi designet denne tilnærmingen ved hjelp av offentlig tilgjengelige protokoller og programvare, slik at enhver forsker med de nødvendige mikroskop- og beregningsressursene kan utføre disse teknikkene. Disse vevsryddings-, bilde- og beregningsverktøyene tillater måling og kvantifisering av den tredimensjonale (3D) organisasjonen av celletyper i cortex og bør være allment anvendelig for enhver wild-type / knockout musestudiedesign.

Helhjerneavbildning ved encelleoppløsning er en viktig utfordring i nevrovitenskap. Hjernebilder med celleoppløsning tillater detaljert analyse og kartlegging på systemnivå av hjernekretser og hvordan kretsene forstyrres av genetiske eller miljømessige risikofaktorer for nevropsykiatriske lidelser, cellulær oppførsel i utvikling av embryoer, samt nevrale kretser i den voksne hjernen ^1,2,3. Det finnes flere histologiske metoder som tillater høyoppløselige bilder av den rekonstruerte 3D-hjernen; Imidlertid krever disse teknikkene dyrt, spesialisert utstyr, kan ikke være kompati....

Alle mus ble brukt i samsvar med og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill.

1. Musdisseksjon og perfusjon

MERK: Følgende disseksjoner ble utført på P4- og P14-mus ved bruk av en sprøyte. Volumet av perfusjonsvæske vil variere avhengig av dyrets alder.

1. Perfusjon
   FORSIKTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farlig kjemikalie. Utfør alle perfusjonstrinn i en kjemisk av.......

Siden iDISCO+-protokollen introduserer betydelig vevskrymping, som lett kan merkes med øyet (figur 2B), la vi til et MR-trinn til denne rørledningen før vevsrydding for å kvantifisere krympingen forårsaket av vevsrydding. Arbeidsflyten starter med fjerning av ikke-hjernevevet fra MR-bildet (figur 2C). Deretter påføres en stiv transformasjon (3 oversettelses- og 3 rotasjonsvinkler) for å justere MR-bildet til lysarkbildet (figur 2D

Vevsryddingsmetoder er nyttige teknikker for å måle 3D-cellulær organisering av hjernen. Det finnes en rekke vevsryddingsmetoder beskrevet i litteraturen, hver med sine fordeler og begrensninger 6,7,8,9. Alternativene for beregningsverktøy for å analysere celletypene i de vevsklarerte bildene er relativt begrensede. Andre tilgjengelige verktøy er implementert for å sparsomme cellepopulas.......

Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01MH121433, R01MH118349, og R01MH120125 til JLS og R01NS110791 til GW) og Foundation of Hope. Vi takker Pablo Ariel fra Microscopy Services Laboratory for å hjelpe til med prøveavbildning. Mikroskopitjenestelaboratoriet ved Institutt for patologi og laboratoriemedisin støttes delvis av Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 til University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core støttes av tilskudd P30 NS045892. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet delvis av North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.