Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.

A limpeza tecidual seguida de microscopia de folha de luz (LSFM) permite a imagem de resolução celular da estrutura cerebral intacta, permitindo a análise quantitativa de mudanças estruturais causadas por perturbações genéticas ou ambientais. A imagem de todo o cérebro resulta em quantificação mais precisa das células e no estudo de diferenças específicas da região que podem ser perdidas com a microscopia comumente usada de tecido fisicamente seccionado. O uso de microscopia de folha de luz para visualizar cérebros limpos aumenta muito a velocidade de aquisição em comparação com a microscopia confocal. Embora essas imagens produzam quantidades muito grandes de dados estruturais cerebrais, a maioria das ferramentas computacionais que realizam a quantificação de características em imagens de tecido limpo são limitadas à contagem de populações de células esparsas, em vez de todos os núcleos.

Aqui, demonstramos o NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), um grupo de ferramentas de análise, para quantificar todos os núcleos e marcadores nucleares dentro de regiões anotadas de um cérebro de rato pós-natal dia 4 (P4) após limpeza e imagem em um microscópio de folha de luz. Descrevemos a ressonância magnética (RM) para medir o volume cerebral antes do encolhimento causado pelas etapas de desidratação da limpeza do tecido, limpeza do tecido usando o método iDISCO +, incluindo imunomarcação, seguida de microscopia de folha de luz usando uma plataforma comercialmente disponível para visualizar cérebros de camundongos em resolução celular. Em seguida, demonstramos esse pipeline de análise de imagem usando o NuMorph, que é usado para corrigir diferenças de intensidade, costurar blocos de imagem, alinhar vários canais, contar núcleos e anotar regiões cerebrais por meio do registro em atlas disponíveis publicamente.

Projetamos essa abordagem usando protocolos e softwares disponíveis publicamente, permitindo que qualquer pesquisador com o microscópio e os recursos computacionais necessários para realizar essas técnicas. Essas ferramentas de limpeza de tecidos, imagens e computação permitem a medição e quantificação da organização tridimensional (3D) dos tipos de células no córtex e devem ser amplamente aplicáveis a qualquer projeto de estudo de camundongo do tipo selvagem / knockout.

A imagem de todo o cérebro em resolução de célula única é um desafio importante na neurociência. As imagens cerebrais de resolução celular permitem a análise detalhada e o mapeamento em nível de sistema dos circuitos cerebrais e como esses circuitos são interrompidos por fatores de risco genéticos ou ambientais para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento celular em embriões em desenvolvimento, bem como circuitos neurais no cérebro adulto ^1,2,3. Existem vários métodos histológicos que permitem imagens de alta resolução do cérebro 3D reconstruído; no entanto, essas técnic....

Todos os camundongos foram utilizados de acordo com e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Dissecção e perfusão do rato

NOTA: As seguintes dissecções foram realizadas em camundongos P4 e P14 usando uma seringa. O volume de fluido de perfusão irá variar dependendo da idade do animal.

1. Perfusão
   CUIDADO: O paraformaldeído (PFA) é um produto.......

Como o protocolo iDISCO+ introduz um encolhimento significativo do tecido, que é facilmente perceptível pelo olho (Figura 2B), adicionamos uma etapa de ressonância magnética a esse pipeline antes da limpeza do tecido para quantificar o encolhimento induzido pelo clareamento tecidual. O fluxo de trabalho começa com a remoção do tecido não cerebral da imagem de RM (Figura 2C). Em seguida, uma transformação rígida (3 ângulos de translação e 3 ângulos.......

Os métodos de limpeza de tecidos são técnicas úteis para medir a organização celular 3D do cérebro. Há uma série de métodos de clareamento tecidual descritos na literatura, cada um com suas vantagens e limitações 6,7,8,9. As opções de ferramentas computacionais para analisar os tipos de células nas imagens limpas por tecidos são relativamente limitadas. Outras ferramentas dispon.......

Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 para JLS e R01NS110791 para GW) e pela Fundação da Esperança. Agradecemos a Pablo Ariel, do Laboratório de Serviços de Microscopia, por auxiliar na imagem da amostra. O Laboratório de Serviços de Microscopia no Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial é apoiado em parte pelo Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 para o Centro Abrangente de Câncer Lineberger da Universidade da Carolina do Norte (UNC). O Núcleo de Microscopia de Neurociência é suportado pela concessão P30 NS045892. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada em parte pelo North Carolina Biotech Center Instit....