Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.

Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.

Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.

Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.

Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге ^1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; одна....

Все мыши использовались в соответствии с и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.

1. Рассечение и перфузия мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие вскрытия были выполнен.......

Поскольку протокол iDISCO+ вводит значительную усадку тканей, которая легко заметна на глаз (рисунок 2B), мы добавили этап МРТ в этот конвейер перед очисткой ткани, чтобы количественно оценить усадку, вызванную очисткой ткани. Рабочий процесс начинается с удаления немозгово.......

Методы очистки тканей являются полезными методами измерения 3D-клеточной организации мозга. Существует множество методов очистки тканей, описанных в литературе, каждый со своими преимуществами и ограничениями 6,7,8,9........

Эта работа была поддержана NIH (R01MH121433, R01MH118349 и R01MH120125 для JLS и R01NS110791 для GW) и Фондом надежды. Мы благодарим Пабло Ариэля из Лаборатории микроскопических услуг за помощь в визуализации образцов. Лаборатория услуг микроскопии в отделении патологии и лабораторной медицины частично поддерживается грантом первичной поддержки Онкологического центра P30 CA016086 Университету Северной Каролины (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Ядро нейробиологической микроскопии поддерживается грантом P30 NS045892. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было частично поддержано грантом институциональной поддержки Биотехнологического центра С....