Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra magnetisk resonansavbildning, rensning och immunmärkning av intakta mushjärnor med hjälp av iDISCO+, följt av en detaljerad beskrivning av avbildning med hjälp av ljusarkmikroskopi och nedströmsanalyser med NuMorph.

Vävnadsrensning följt av ljusarkmikroskopi (LSFM) möjliggör cellulär upplösningsavbildning av intakt hjärnstruktur, vilket möjliggör kvantitativ analys av strukturella förändringar orsakade av genetiska eller miljömässiga störningar. Helhjärnavbildning resulterar i mer exakt kvantifiering av celler och studier av regionspecifika skillnader som kan missas med vanligt förekommande mikroskopi av fysiskt snittad vävnad. Att använda ljusarkmikroskopi för att avbilda rensade hjärnor ökar förvärvshastigheten kraftigt jämfört med konfokalmikroskopi. Även om dessa bilder producerar mycket stora mängder hjärnstrukturdata, är de flesta beräkningsverktyg som utför funktionskvantifiering i bilder av rensad vävnad begränsade till att räkna glesa cellpopulationer, snarare än alla kärnor.

Här demonstrerar vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en grupp analysverktyg, för att kvantifiera alla kärnor och kärnmarkörer inom kommenterade regioner i en postnatal dag 4 (P4) mushjärna efter rensning och avbildning på ett ljusarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonanstomografi (MRI) för att mäta hjärnvolymen före krympning orsakad av vävnadsrensande uttorkningssteg, vävnadsrensning med iDISCO+-metoden, inklusive immunmärkning, följt av ljusarkmikroskopi med hjälp av en kommersiellt tillgänglig plattform för att avbilda mushjärnor med cellulär upplösning. Vi demonstrerar sedan den här bildanalyspipelinen med NuMorph, som används för att korrigera intensitetsskillnader, sy bildpaneler, justera flera kanaler, räkna kärnor och kommentera hjärnregioner genom registrering till offentligt tillgängliga atlaser.

Vi utformade detta tillvägagångssätt med hjälp av offentligt tillgängliga protokoll och programvara, så att alla forskare med nödvändiga mikroskop och beräkningsresurser kan utföra dessa tekniker. Dessa vävnadsrensnings-, avbildnings- och beräkningsverktyg möjliggör mätning och kvantifiering av den tredimensionella (3D) organisationen av celltyper i cortex och bör vara allmänt tillämplig på alla vilda typer / knockout-musstudiedesigner.

Helhjärnavbildning med encellsupplösning är en viktig utmaning inom neurovetenskapen. Hjärnbilder med cellulär upplösning möjliggör detaljerad analys och kartläggning på systemnivå av hjärnkretsar och hur dessa kretsar störs av genetiska eller miljömässiga riskfaktorer för neuropsykiatriska störningar, cellulärt beteende vid utveckling av embryon samt neurala kretsar i den vuxna hjärnan ^1,2,3. Det finns flera histologiska metoder som möjliggör högupplösta bilder av den rekonstruerade 3D-hjärnan; Dessa tekniker kräver dock dyr, specialiserad utrustning, kanske inte är kompatib....

Alla möss användes i enlighet med och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill.

1. Musdissektion och perfusion

OBS: Följande dissektioner utfördes på P4- och P14-möss med hjälp av en spruta. Volymen av perfusionsvätska varierar beroende på djurets ålder.

1. Perfusion
   VARNING: Paraformaldehyd (PFA) är en farlig kemikalie. Utför alla perfusionssteg i en kemi.......

Eftersom iDISCO+-protokollet introducerar betydande vävnadskrympning, vilket lätt märks av ögat (figur 2B), lade vi till ett MR-steg i denna pipeline före vävnadsrensning för att kvantifiera krympningen som induceras av vävnadsrensning. Arbetsflödet börjar med att ta bort icke-hjärnvävnaden från MR-bilden (figur 2C). Därefter appliceras en styv transformation (3 översättnings- och 3 rotationsvinklar) för att justera MR-bilden till ljusarkbilden .......

Vävnadsrensningsmetoder är användbara tekniker för att mäta 3D-cellulär organisation av hjärnan. Det finns en mängd vävnadsrensningsmetoder som beskrivs i litteraturen, var och en med sina fördelar och begränsningar 6,7,8,9. Alternativen för beräkningsverktyg för att analysera celltyperna i de vävnadsrensade bilderna är relativt begränsade. Andra tillgängliga verktyg har imple.......

Detta arbete stöddes av NIH (R01MH121433, R01MH118349 och R01MH120125 till JLS och R01NS110791 till GW) och Foundation of Hope. Vi tackar Pablo Ariel från Microscopy Services Laboratory för att ha hjälpt till med provavbildning. Microscopy Services Laboratory vid Institutionen för patologi och laboratoriemedicin stöds delvis av Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 till University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core stöds av bidrag P30 NS045892. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.