JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Neuroscience

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Published: August 1st, 2022

DOI:

10.3791/64096

1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Doku temizlemenin ardından ışık tabakası mikroskobu (LSFM), bozulmamış beyin yapısının hücresel çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu yapısal değişikliklerin nicel analizine izin verir. Tüm beyin görüntülemesi, hücrelerin daha doğru bir şekilde ölçülmesi ve fiziksel olarak kesitlenmiş dokunun yaygın olarak kullanılan mikroskopisi ile gözden kaçırılabilecek bölgeye özgü farklılıkların incelenmesi ile sonuçlanır. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için ışık tabakası mikroskobu kullanmak, konfokal mikroskopiye kıyasla edinme hızını büyük ölçüde artırır. Bu görüntüler çok büyük miktarlarda beyin yapısal verisi üretmesine rağmen, temizlenmiş doku görüntülerinde özellik ölçümü yapan çoğu hesaplama aracı, tüm çekirdeklerden ziyade seyrek hücre popülasyonlarını saymakla sınırlıdır.

Burada, bir ışık tabakası mikroskobunda temizlendikten ve görüntülendikten sonra, doğum sonrası 4. gün (P4) fare beyninin açıklamalı bölgelerindeki tüm çekirdekleri ve nükleer belirteçleri ölçmek için bir grup analiz aracı olan NuMorph'u (Nükleer Tabanlı Morfometri) gösteriyoruz. Doku temizleme dehidrasyon adımlarının neden olduğu büzülmeden önce beyin hacmini ölçmek için manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG), immünoetiketleme de dahil olmak üzere iDISCO + yöntemini kullanarak doku temizlemeyi ve ardından fare beyinlerini hücresel çözünürlükte görüntülemek için ticari olarak temin edilebilen bir platform kullanarak ışık tabakası mikroskobu kullanıyoruz. Daha sonra, yoğunluk farklılıklarını düzeltmek, görüntü döşemelerini dikmek, birden fazla kanalı hizalamak, çekirdekleri saymak ve genel kullanıma açık atlaslara kayıt yoluyla beyin bölgelerine açıklama eklemek için kullanılan NuMorph'u kullanarak bu görüntü analizi işlem hattını gösteriyoruz.

Bu yaklaşımı, gerekli mikroskop ve hesaplama kaynaklarına sahip herhangi bir araştırmacının bu teknikleri gerçekleştirmesine izin veren halka açık protokolleri ve yazılımları kullanarak tasarladık. Bu doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçları, korteksteki hücre tiplerinin üç boyutlu (3B) organizasyonunun ölçülmesine ve nicelleştirilmesine izin verir ve herhangi bir vahşi tip / nakavt fare çalışması tasarımına yaygın olarak uygulanmalıdır.

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir 1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, öze....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm fareler, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak kullanılmış ve onaylanmıştır.

1. Fare diseksiyonu ve perfüzyonu

NOT: Aşağıdaki diseksiyonlar P4 ve P14 farelerde bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Perfüzyon sıvısının hacmi, hayvanın yaşına bağlı olarak değişecektir.

  1. Perfüzyon
    DİKKAT: Paraformaldehit (PFA) te.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

iDISCO+ protokolü, gözle kolayca fark edilebilen önemli doku büzülmesini beraberinde getirdiğinden (Şekil 2B), doku temizlemenin neden olduğu büzülmeyi ölçmek için doku temizlemeden önce bu boru hattına bir MRI adımı ekledik. İş akışı, beyin dışı dokunun MR görüntüsünden çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2C). Daha sonra, MR görüntüsünü ışık tabakası görüntüsüne hizalamak için katı bir dönüşüm (3 çeviri ve 3 dön?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Doku temizleme yöntemleri, beynin 3D hücresel organizasyonunu ölçmek için yararlı tekniklerdir. Literatürde tanımlanan ve her biri avantajları ve sınırlamaları olan bir dizi doku temizleme yöntemi vardır 6,7,8,9. Doku temizlenmiş görüntülerdeki hücre tiplerini analiz etmek için hesaplama araçlarının seçenekleri nispeten sınırlıdır. Segmentasyonun daha az zor olduğu .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma NIH (R01MH121433, R01MH118349 ve R01MH120125 JLS'ye ve R01NS110791'den GW'ye) ve Umut Vakfı tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı'ndan Pablo Ariel'e örnek görüntülemeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı'ndaki Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı, kısmen Kuzey Carolina Üniversitesi (UNC) Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'ne Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibe P30 CA016086 tarafından desteklenmektedir. Nörobilim Mikroskopi Çekirdeği, hibe P30 NS045892 tarafından desteklenmektedir. Bu yayında bildirilen araştırmalar kısmen Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi Kurumsal Destek Hibe 2016-IDG-....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
  26. . Anaconda Distribution - Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  34. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  35. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  36. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  37. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  38. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  39. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  40. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved