종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

Summary

종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.

Abstract

종양 구상체는 기본적인 암 연구 및 약물 개발에서 빠르게 보편화되고 있습니다. 세포 수준에서 스페로이드 내 단백질 발현에 관한 데이터를 얻는 것은 분석에 중요하지만, 기존 기술은 종종 비싸고, 힘들며, 비표준 장비를 사용하거나, 상당한 크기 왜곡을 일으키거나, 상대적으로 작은 구상체로 제한됩니다. 이 프로토콜은 구상체의 내부 구조에 대한 공초점 분석을 허용하면서 이러한 문제를 해결하는 구상체를 장착 및 제거하는 새로운 방법을 제시합니다. 기존의 접근 방식과는 달리, 이 프로토콜은 표준 장비 및 실험실 소모품을 사용하여 많은 수의 구상체를 신속하게 장착하고 제거할 수 있도록 합니다. 굴절률 매칭 클리어링 용액을 도입하기 전에 pH-중성 아가로스-PBS 겔 용액에 스페로이드를 장착하면 다른 유사한 기술에 공통적인 크기 왜곡이 최소화됩니다. 이를 통해 크기 측정의 정확도가 가장 중요한 상세한 정량 및 통계 분석이 가능합니다. 또한, 액체 클리어링 솔루션과 비교하여, 아가로스 겔 기술은 구상체를 제자리에 고정시켜 3차원(3D) 공초점 이미지를 수집할 수 있게 합니다. 이 기사에서는 이 방법이 셀 간 가변성 및 내부 스페로이드 구조에 대한 정보를 제공하는 고품질 두 개 및 3D 이미지를 생성하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

구상체와 같은 3차원(3D) 세포 배양물은 집합체 세포 성장^(1,2)의 생물학적으로 현실적이고 재현 가능한 모델을 제공한다. 이러한 모델은 약물 효능을 확인하기 위해 치료 사이에 스페로이드 크기와 구조의 차이를 조사하는 기본 연구 및 약물 개발 모두에서 빠르게 보편화되고 있습니다 ^3,4. 이러한 맥락에서, 많은 수의 구상체로부터 상세한 정보를 수집하는 능력은 통계적 힘의 관점에서 그리고 여러 치료에 걸쳐 세포 거동을 신속하게 평가할 수 있도록 하는 매우 유리하다.

스페로이드 구조의 상세한 현미경 이미지를 얻기 위해 일반적으로 사용되는 기술은 시간이 많이 걸리거나 비용이 많이 들거나 스페로이드 크기 ^4,5와 같은 주요 정량적 기능을 유지하지 않는 저품질 이미지를 생성합니다. 예를 들어, 냉동 절제술에 기초한 조직학적 기술은 고품질 이미지를 제공할 수 있지만, 종종 시간이 많이 걸리고, 숙련된 노동력이 필요하며, 종종 단면화 인공물(^6,7)을 생성하는 반면, 단일 평면 조명 현미경(SPIM)⁸ 및 다중 광자 현미경^(multiphoton microscopy)9와 같은 우아한 기술은 쉽게 구할 수 없는 특수 현미경을 필요로 한다. 현대 현미경 기술은 최근에 구상체가 굴절률과 일치하는 클리어링 용액 내에 배치되고 공초점 현미경 ^4,5를 사용하여 이미지를 얻는 소위 광학 단면화를 가능하게했습니다. 이러한 기술은 높은 수율을 생성 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 일반적인 문제는 이미징 중 스페로이드 이동, 지우기 중 크기 왜곡 및 독점적 인 클리어링 솔루션의 높은 비용을 포함합니다. 더욱이, 많은 기존 프로토콜은 직경이 300 μm 미만이거나 깊이가 최대 100 μm인 비교적 작은 구상체에만 적용되어, 이 기술을 종양 성장의 초기 단계인 ^5,10,11로 제한한다.

본 프로토콜은 전체 기관 클리어링 절차^(12,13)로부터 유도된 저비용 굴절률-매칭 클리어링 솔루션을 사용하여 상세한 스페로이드 이미지의 반-고처리량^, 고수율 수집을 허용한다. 이미징 중 스페로이드 이동을 방지하고 크기 왜곡을 줄이기 위한 구조적 지지대를 제공하기 위해 스페로이드는 24웰 #1.5 유리 바닥판의 agarose-PBS 젤에 장착됩니다. 이 기술을 통해 24웰 플레이트의 각 웰에 여러 개의 스페로이드를 장착할 수 있기 때문에 다양한 실험 조건에서 최대 360개의 스페로이드(15개의 스페로이드/웰)를 신속하게 장착하고 이미징할 수 있습니다. 쉽게 구할 수 있는 소모품으로 구성된 굴절률 일치 클리어링 솔루션은 장착된 구상체와 주변 젤을 광학적으로 제거하는 데 사용됩니다. 24시간의 침전 기간 후에, 이 프로토콜은 2% 미만의 크기 왜곡으로 비교적 큰 구상체(직경 약 700μm)에 대해서도 스페로이드 구조의 고품질 2D 및 3D 이미지를 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜은 웰 당 200 μL의 아가로스 겔 및 웰 당 500 μL의 클리어링 용액에서 하나의 24-웰 플레이트 (약 240-360 스페로이드 또는 10-15 스페로이드 / 웰)를 장착하기에 충분한 양의 종양 구상체의 제조를 설명합니다. 전체 절차는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 2% 아가로스-PBS 겔 제제

1. 유리 병에 저융점 아가로스 0.5g( 물차표 참조)을 싣고 인산완충식염수(PBS) 25mL를 첨가한다.
2. 뚜껑을 닫지 않고 밀봉하지 않고 일정한 소용돌이로 30-60 초 동안 전자 레인지에서 용액을 끓여서 아가로스를 녹입니다. 아가로스가 완전히 용해되고 용액이 끓지 않도록하십시오.
   참고 : 젤은 실온에서 보관할 수 있습니다. 증발을 설명하기 위해 사용하기 전에 볼륨을 확인하십시오. 사용하기 전에 액체 상태 (전자 레인지, 소용돌이 치는 20-60 초)로 가져 오십시오.

2. 청산액의 제조

1. 무게는 9g의 N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민, 22g의 요소, 44g의 수크로오스, 0.1g의 트리톤 X-100 및 24.9g의 탈이온수를 계량한다(물차표 참조).
   참고 : N,N,N',N'-Tetrakis (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민의 대략적인 양을 측정하고 원하는 농도를 얻기 위해 다른 성분의 무게를 조정하는 것이 더 쉽습니다.
2. 용액을 일정한 혼합으로 56°C 수조에서 가열하고 모든 결정이 용해될 때까지 계속한다.
3. 혼합 중에 형성된 기포가 표면으로 상승 할 수 있도록 용액을 실온에서 휴식시킵니다. 용액은 실온에서 최대 2 개월 동안 안정적입니다.

3. 스페로이드 준비

1. 앞서 기술한^바와 같이 아가로스 오버레이 방법을 사용하여 구상체를 생성한다 ^1,3,14.
   참고: 다른 방법으로 생성된 스페로이드도 이 이미징 프로토콜과 호환됩니다.
2. 오리피스를 확대하기 위해 메스를 사용하여 1 mL 피펫 팁의 팁을 자릅니다.
   참고: 모든 구상체는 절단 팁이 있는 1 mL 또는 200 μL 피펫으로 처리하였다.
3. 피펫을 사용하여 웰에서 구상체를 흡인하여 명확한 1.5mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 동일한 조건의 여러 구상체를 동일한 튜브에 결합 할 수 있습니다.
   참고 : 항상 구상체가 튜브 바닥에 정착하여 매체를 흡인하도록하십시오.
4. 구상체를 PBS 1 mL로 두 번 세척하고, 중성 4% 예열 파라포름알데히드(PFA) 용액을 첨가하고, 37°C에서 20분 동안 구상체를 인큐베이션한다.
5. PFA 용액을 제거하고 PBS 1 mL로 구상체를 두 번 세척하였다.

4. 스페로이드 염색

1. 피펫을 사용하여 최대 15개의 구상체를 200 μL PCR 튜브로 옮깁니다.
   참고: 깨지기 쉬운 구상체의 경우, 계속하기 전에 구상체를 젤에 장착하십시오 (5.1-5.4 단계).
2. PBS 중의 0.5% 트리톤 X-100의 200 μL를 사용하여 세포를 투과시킨다. PCR 튜브를 50 mL 스크류-캡 튜브 내부에 위치시키고, 온화한 교반으로 실온에서 2시간 동안 구상체를 인큐베이션한다.
   참고: 모든 인큐베이션은 달리 명시되지 않는 한 로터, 롤러 또는 쉐이커( 재료 표 참조)에서 교반을 통해 수행됩니다. 이것은 균일 한 염색을 달성하는 데 중요합니다. PBS의 고정 구상체는 때때로 피펫 팁의 측면에 달라 붙을 수 있습니다. 0.5 % Triton X-100으로 팁을 헹구면 구상체가 팁에 달라 붙는 것을 최소화합니다.
3. 용액 (단계 4.2)을 200 μL의 항체 희석 완충액 (ABDIL)¹⁵ 로 교체하고 실온에서 밤새 인큐베이션한다.
4. ABDIL을 제거하고, 75 μL의 일차 항체를 ABDIL에 첨가하고, 4°C에서 2.5일 동안 인큐베이션한다.
5. 상청액을 제거하고 200 μL의 PBS로 0.1% 트윈 및 0.1% 트리톤 X-100 (PBS-TT)으로 2회 세척하고 실온에서 4시간 동안 200 μL의 PBS-TT와 함께 인큐베이션한다.
6. PBS-TT를 제거하고, 100 μL의 이차 항체를 ABDIL에 첨가하고, 4°C에서 2.5일 동안 인큐베이션한다.
   참고 : DAPI 또는 다른 핵 염료는이 단계에서 첨가 될 수 있습니다. 대부분의 염료는 항체보다 더 적은 배양 시간을 필요로합니다.
7. 상층액을 제거하고 200 μL의 PBS-TT로 2회 세척하고 200 μL의 PBS-TT와 함께 4시간 동안 인큐베이션한다. 구상체는 장착 할 준비가되었습니다.

5. 장착

1. 200 μL 피펫을 사용하여, 고정 및 염색된 구상체를 조건당 하나의 튜브(대략 10-15개의 구상체)에서 500 μL PCR 튜브로 옮긴다.
2. 용액을 200 μL의 2 % (w / v) 액체 아가로스 겔로 교체하고 실온에서 30 초 동안 빠른 스핀 (고정 된 최대 속도로, 재료 표 참조)에서 원심 분리하십시오.
   주: 즉시 장착하지 않는 한, 겔 경화를 피하기 위해 50°C의 가열 블록에 두십시오.
3. 구상체를 ∼50 μL 액체 아가로스 겔에 흡인하고, 24-웰 유리 바닥 플레이트의 웰에 분배한다.
4. 젤이 경화되기 전에 주변 젤의 피펫 팁을 사용하여 구상체를 분리하고 구상체가 젤로 덮여 있는지 확인하십시오. 선택적으로, 플레이트를 얼음 위에 놓아 겔을 빠르게 세팅한다.
   참고 : 우물 당 구상체의 수는 구상체의 크기에 따라 다릅니다. 구상체는 서로 멀리 떨어져 배치되어 이미징하는 동안 하나의 스페로이드 만 시야에 들어갑니다. 이는 자동화된 이미지 처리에 중요합니다.
5. 웰 당 500 μL의 클리어링 용액 (단계 2)을 첨가하여 겔이 침수되도록 한다. RT에서 최소 24시간 동안 인큐베이션하고 클리어링 용액에서 구상체를 이미지화합니다. 구상체는 실온에서 최대 한 달 동안이 용액에서 안정하며 증발로부터 보호 될 때 안정적입니다.

6. 이미징

1. 선박에 스페로이드의 장착 높이를 포함하여 전체 구상체를 포괄 할만큼 충분히 긴 작동 거리의 목표를 선택하십시오.
   참고: 작동 거리가 3mm 이상인 물체는 구상체의 적도 평면을 이미지화하는 데 필요합니다. 더 높은 NA를 갖는 더 높은 배율 목표는 더 나은 해상도를 허용할 수 있지만, 구상체가 이미지화될 수 있는 최대 깊이를 제한할 것이다.
2. 적도 평면을 식별하려면 XY 평면에서 가장 큰 표면적에 도달할 때까지 초점을 조정하고 필요한 레이저 출력 백분율, 검출기 전압, 게인 및 오프셋 설정을 사용하여 이미지를 제공합니다.
   참고: 레이저 출력 백분율, 검출기 전압, 이득 및 오프셋은 형광단, 염색 강도, 레이저 강도, 검출기 감도 등에 따라 크게 달라집니다.
3. 3D 이미지의 경우 구상체의 시작과 끝을 설정하고 이미징 전에 z 강도 보정 설정을 사용하여 다양한 z-깊이에서 적절한 신호 강도를 선택합니다.
   참고: 최상의 이미지 해상도를 얻으려면 x, y 및 z에 대해 나이퀴스트 샘플링 속도를 사용하십시오(자세한 내용은 참조¹⁶ 참조).

Discussion

종양 구상체의 고품질 이차원 및 입체 이미지를 얻기 위한 프로토콜이 여기에 제시된다. CLARITY, See deep brain (SeeDB) 및 ScaleS와 같은 기존 방법은 종종 최대 30 %까지 크기 왜곡을 일으키는 반면, 벤질 알코올 / 벤질 벤조에이트 (BABB) 및 용매 제거 된 기관의 3D 이미징 (3DISCO)과 같은 기술은 형광 단백질⁽¹⁸)을 급냉시킬 수 있습니다. 이들 방법들 중 다수는 구조적 완전성을 갖는 조직을 클리어링하고 구상체(¹⁸)에 적용될 때 크기 및 구조를 왜곡하도록 설계된다. 상업적으로 이용 가능한 고가의 클리어링 솔루션을 사용하는 다른 프로토콜과는 달리, 이 프로토콜은 광학 선명도와 내인성 형광을 유지하고 크기 왜곡을 최소화하면서 쉽게 사용할 수 있는 소모품을 사용합니다. 아가로스-PBS 겔에 구상체를 내장하면 구상체에 대한 구조적 지지가 제공되며 클리어링 용액이 첨가될 때 삼투압 충격을 최소화할 수 있습니다. 이것은 약물 치료 후 깨지기 쉬운 구상체를 이미징 할 때 중요합니다. 이 광학 클리어링 방법은 이 프로토콜이 전체 조직 클리어링으로부터 적응되기 때문에 임의의 방법에 의해 형성된 구상체에 적합하다고 가정된다. 가정은 상이한 스페로이드 형성 방법에 의해 수득된 구상체에서의 유사성에 기초한다. 고정제의 선택은 스페로이드 크기뿐만 아니라 내인성 형광에도 영향을 줄 수 있습니다. 이 클리어링 방법은 중성 4% PFA 용액으로 고정된 구상체에 적합합니다. 다른 고정 장치와의 호환성을 확인하기 위해서는 추가 테스트가 필요합니다.

이 기술을 통해 다중 스페로이드를 다중 웰 플레이트에 동시에 장착할 수 있다는 점을 감안할 때, 24웰 플레이트당 최대 360개의 스페로이드 구조 정보가 필요한 정량적 분석 파이프라인에 매우 적합합니다. 자동화된 스테이지 및 플레이트 매핑 기능을 갖춘 현미경은 이미징을 덜 수동으로 만들 수 있습니다. 이 방법은 단면화보다 빠르고 쉽지만 현재 완전한 자동화에는 적합하지 않습니다. 그러나, 이 방법에 의해 획득된 이미지들은 자동화된 이미지 프로세싱(^4,19)에 적합하며, 이 프로토콜을 사용하여 스페로이드가 장착될 수 있는 속도는 스페로이드 내부 구조(^20,21,22)의 정량적 분석에 도움이 ^된다.

전체 구상체를 염색하기 위해, 항체 농도, 부피 및 인큐베이션 시간은 모든 항체에 대해 최적화되어야 한다. 가이드로서 튜브 당 구상체 수에 따라 권장되는 2D 면역 형광 항체 농도의 2.5x 및 항체 100-200 μL를 사용하십시오. 로터에있을 때 모든 구상체가 염색 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 인큐베이션 시간은 구상체 및 항체의 크기 및 밀도를 포함하는 많은 인자에 의존하며, 16-72 h의 범위일 수 있다. 구상체 내에서 더 깊은 신호 검출을 허용하는 방법에도 불구하고, UV에 의해 여기된 형광단은 상당한 광 산란을 일으켜 낮은 신호 대 잡음비를 초래한다. 표적 단백질을 시각화하기 위해 형광단을 선택할 때는주의를 기울여야합니다. 예를 들어, 더 긴 파장의 형광단과 더 풍부한 단백질 또는 핵 염색을 더 짧은 파장의 형광단으로 덜 풍부하고 구조적인 단백질을 염색하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 클리어 된 구상체는 괴사 성 코어의 산란으로 인한 광 손실을 여전히 보여 주며, 600 μm 구상체로 얻은 이미지의 y / z 차원에서 분명합니다 (그림 2C).

더 높은 NA 목표를 가진 더 높은 배율 이미징은이 프로토콜을 사용하여 구상체를 장착하고 클리어하면 가능하지만 목표의 작동 거리는 이미징 깊이를 제한합니다. 오일 침지 렌즈의 경우 최상의 결과를 얻으려면 RI가 1.51인 오일을 사용하는 것이 중요합니다.

요약하면, 아가로스-PBS 겔 임베디드 클리어링 방법은 일반적으로 이용가능한 소모품을 사용하여 구상체 내부 깊숙한 곳의 세포를 시각화할 수 있게 한다. 이 방법을 사용하여 장착 및 클리어된 스페로이드는 최소한의 크기 왜곡을 거치며 구조적 무결성을 유지하므로 내부 스페로이드 구조 및 후속 자동 정량화와 관련된 고품질 데이터를 수집할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass bottom 24-well plate	Celvis	P24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubes	Sigma	HS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno research	715-605-151	Dilution used 1:500
Bovine serum albumin	Sigma	A7906	Final concentration 2% w/v
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Final concentration 5 µg/mL
Deionized water	MILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermofisher	A-31573	Dilution used 1:500
DRAQ7	Thermofisher	D15106	Dilution used 1:250
Heating block	Ratek	DBH10	or similar equipment
Hypoxyprobe Kits	Hypoxyprobe	HP1-1000Kit	Antibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powder	Sigma	A9414	Final concentration 2% w/v
Microwave	Sharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma	122262	Final concentration 9% w/w
NaCl	Sigma	S9888	Final concentration 150 mM
NaN3	Sigma	S2002	Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XP	Cell Signalling technology	3686S	Dilution used 1:500
Paraformaldehyde solution	Proscitech	C004	Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher	18912014	Final concentration 1x
Pipette	Eppendorf
Quickspin minifuge			or similar equipment
Roller	Ratek	BTR10-12V	or similar equipment
Rotor	Ratek	RSM7DC	or similar equipment
Shaker	Ratek	EOM5	or similar equipment
Sucrose	Sigma	S9378	Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T5941	Final concentration 20 mM
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.1% v/v
Tween 20	Sigma	P1379	Final concentration 0.1% v/v
Urea	Sigma	U5379	Final concentration 22% w/w