Основные компоненты анализов транскрипции Borreliella (Borrelia) burgdorferi in vitro

Резюме

Анализы транскрипции in vitro могут расшифровать механизмы регуляции транскрипции у Borreliella burgdorferi. Этот протокол описывает этапы очистки РНК-полимеразы B. burgdorferi и проведения реакций транскрипции in vitro. Экспериментальные подходы с использованием анализов транскрипции in vitro требуют надежной очистки и хранения активной РНК-полимеразы.

Аннотация

Borreliella burgdorferi — бактериальный патоген с ограниченным метаболическим и геномным репертуаром. B. burgdorferi проходит внеклеточно между позвоночными и клещами и резко реконструирует свой транскрипционный профиль, чтобы выжить в разрозненных средах во время инфекции. Основное внимание в исследованиях B. burgdorferi уделяется четкому пониманию того, как бактерии реагируют на окружающую среду посредством транскрипционных изменений. Анализы транскрипции in vitro позволяют биохимически препарировать основные механизмы регуляции транскрипции. Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий очистку и хранение РНК-полимеразы B. burgdorferi , очистку сигма-фактора, генерацию матрицы ДНК и анализы транскрипции in vitro . В протоколе описано использование РНК-полимеразы, очищенной от B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC представляет собой ранее опубликованный штамм, содержащий 10XHis-метку на гене rpoC , кодирующую самую большую субъединицу РНК-полимеразы. Анализы транскрипции in vitro состоят из РНК-полимеразы, очищенной от штамма 5A4-RpoC, рекомбинантной версии домашнего сигма-фактора RpoD и двухцепочечной матрицы ДНК, сгенерированной ПЦР. В то время как методы очистки белка и подходы к сборке анализов транскрипции in vitro концептуально хорошо изучены и относительно распространены, соображения обработки РНК-полимераз часто различаются от организма к организму. Представленный здесь протокол предназначен для ферментативных исследований РНК-полимеразы B. burgdorferi. Метод может быть адаптирован для проверки роли транскрипционных факторов, промоторов и посттрансляционных модификаций на активность РНК-полимеразы.

Введение

Болезнь Лайма и возвратный тиф вызываются возбудителями спирохет родов Borrelia и Borreliella ^1,2,3. Болезнь Лайма является известным трансмиссивным заболеванием в Северной Америке, и, следовательно, Borreliella burgdorferi является выдающимся модельным организмом для изучения биологии спирохеты ^4,5. Исследования механизмов регуляции транскрипции B. burgdorferi направлены на то, чтобы лучше понять его адаптацию к изменениям в окружающей среде, когда он циклически переключается между....

протокол

1. Очистка РНК-полимеразы и получение РНК-полимеразного сырья

1. Собирают клеточную гранулу из 2-4 л B. burgdorferi RpoC-His10X, культивируемой в среде BSKII в микроаэрофильной среде (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) до плотности_2-4 x 10⁷ клеток/мл с использованием ранее описанных протоколов клеточного сбора ^28,29. Проведите центрифугирование при 10 000 x g при 4 ° C в течение 30 мин в центробежных бутылках по 500 мл и слейте надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируют клетки в 30 мл ледяного буфера HN (10 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, pH 8,0). Повт....

Результаты

В реакции транскрипции in vitro , в которой ограничивающим этапом реакции является инициация транскрипции, опосредованная сигма-фактором, активность транскрипции должна линейно увеличиваться с количеством сигма-фактора. Мы представляем подготовку экспериментов по транскрипции in.......

Обсуждение

Анализы транскрипции in vitro, построенные с использованием представленного протокола, недавно были использованы для изучения роли транскрипционного фактора у B. burgdorferi и могут быть применены для построения аналогичных экспериментов с использованием других транскрипционных фа.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14