使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集

Summary

本协议描述了冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据收集的通用且易于实施的方案。对于由于粘附空气-水界面而遭受优先方向偏差的样品，该程序对于获得高质量的EM图特别有用。

Abstract

通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行的单颗粒分析（SPA）现在是高分辨率结构生物学的主流技术。SPA的结构测定依赖于获得在薄冰层内玻璃化的大分子物体的多个不同视图。理想情况下，均匀分布的随机投影方向的集合将相当于物体的所有可能视图，从而产生以各向同性方向分辨率为特征的重建。然而，在现实中，许多样品都受到粘附在空气-水界面上的优先取向颗粒的影响。这导致数据集中的角度取向分布不均匀，重建中出现不均匀的傅里叶空间采样，从而转化为以各向异性分辨率为特征的地图。倾斜试样载物台提供了一种可推广的解决方案，通过提高取向分布的均匀性，从而改善傅里叶空间采样的各向同性，克服分辨率各向异性。该协议描述了使用Leginon（一种用于自动图像采集的软件）的倾斜阶段自动数据收集策略。该程序易于实施，不需要任何额外的设备或软件，并且与用于生物大分子成像的大多数标准透射电子显微镜（TEM）兼容。

Introduction

在过去十年中，直接电子探测器¹，²，³的出现刺激了使用单粒子冷冻电镜⁴，^5，6解决的大分子和大分子组件的高分辨率结构的数量呈指数级增长。几乎所有纯化的大分子物质都有望使用冷冻电镜进行结构测定，除了最小的蛋白质~10 kDa大小或小于⁷。网格制备和结构测定所需的起始材料量至少比其他结构测定技术（如核磁共振波谱和X射线^晶体学4，^5，6）少一个数量级。

然而，通过冷冻电镜测定结构的主要挑战涉及合适的成像网格准备。一项使用不同玻璃化策略和网格评估不同样品的广泛研究表明，在冷冻电镜网格上玻璃化样品的大多数方法都会导致大分子优先粘附在空气-水界面上⁸。这种依从性可能导致四个次优结果：（1）大分子样....

Protocol

1. 样品制备

1. 使用包含金箔和金网格支撑的网格¹⁶ （见 材料表），因为倾斜的数据收集会突出光束引起的运动¹⁷。
   注意：对于本研究，在加湿（大于80%）的冷藏室（~4°C）中使用手动浸入和印迹技术¹⁸ 对网格上的样品进行玻璃化。
2. 除非绝对必要，否则避免使用包含铜支架和碳箔的网格或连续的非晶碳层，因为这些网格可能导致当样品台倾斜时更大的光束诱导运动¹⁶ 。
   注意：与非晶碳¹⁹，²⁰相比^，替代支撑层（例如石墨烯/氧化石墨烯）似乎减少了光束引起的运动。
3. 预先筛选网格并确定以可接受的冰厚度和颗粒分布为特征的区域。包含太紧密堆积颗粒的网格将导致倾斜数据收集过程中颗粒重叠，这可能会影响下游数据处理步骤。
   注意：这些步骤是主观的，因为通过目视检查颗粒对比度清晰的区域的散焦图像来识别良好的冰区域。这可能不适用于所有样品，因为某些样品无法在薄冰区域有效分布，导致数据收集过程中出现挑战（在讨论部分描述）。
4. 玻璃化含有蛋白质样品的网格。在这里，出于演示目的，我们使用饥饿期间的DNA保护....

Discussion

由样品粘附在空气-水界面上引起的首选颗粒取向是使用冷冻电镜SPA⁴，^5，6进行常规高分辨率结构测定的最后一个主要瓶颈之一。这里介绍的数据收集方案提供了一种易于实现的策略，用于改善数据集中粒子的方向分布。我们注意到，该协议不需要额外的设备或软件，也不会影响数据收集速度。在倾斜样品的数据采集过程中，?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01