Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
تحديد الكاسباس وزخارفه التي تشق البروتينات أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا أ
تنشط عدوى فيروس الأنفلونزا A (IAV) الكاسباز الذي يشق المضيف والبروتينات الفيروسية ، والتي بدورها لها وظائف مؤيدة ومضادة للفيروسات. من خلال استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، والنشاف الغربي وتقنيات RT-qPCR ، تم تحديد الكاسباز في خلايا الثدييات المصابة التي تشق الكورتاكتين المضيف و deacetylases هيستون.
Caspases ، وهي عائلة من بروتياز السيستين ، تنظم موت الخلايا المبرمج استجابة للمحفزات المختلفة ، بما في ذلك الالتهابات الميكروبية. وصف موت الخلايا المبرمج في البداية بأنه يحدث عن طريق موت الخلايا المبرمج ، ومن المعروف الآن أنه يشمل ثلاثة مسارات مترابطة: pyroptosis ، وموت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، والتي صيغت معا كعملية واحدة ، PANoptosis. تأثير عدوى الفيروس (IAV) يحفز PANoptosis في خلايا الثدييات عن طريق تحفيز تنشيط caspases مختلفة ، والتي بدورها تشق العديد من البروتينات المضيفة وكذلك الفيروسية ، مما يؤدي إلى عمليات مثل تنشيط الاستجابة الفطرية المضادة للفيروسات المضيفة أو تدهور البروتينات المضيفة المعادية. في هذا الصدد ، تم اكتشاف انشقاق كاسباز 3 بوساطة كورتاكتين المضيف ، وهيستون ديسيتيلاز 4 (HDAC4) ، وهيستون ديسيتيلاز 6 (HDAC6) في كل من الخلايا الظهارية الحيوانية والبشرية استجابة لعدوى IAV. لإثبات ذلك ، تم استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، وبعد ذلك ، تم قياس الانقسام أو مقاومة الانقسام واستعادة الكورتاكتين ، HDAC4 ، و HDAC6 polypeptide بواسطة النشاف الغربي. تشكل هذه الطرق ، جنبا إلى جنب مع RT-qPCR ، استراتيجية بسيطة ولكنها فعالة لتحديد المضيف وكذلك البروتينات الفيروسية التي تخضع للانقسام بوساطة caspase أثناء الإصابة ب IAV أو الفيروسات البشرية والحيوانية الأخرى. ويفصل هذا البروتوكول النتائج التمثيلية لهذه الاستراتيجية، كما تناقش سبل جعلها أكثر فعالية.
فيروس الأنفلونزا A (IAV) هو العضو النموذجي في عائلة Orthomyxoviridae ومن المعروف أنه يسبب أوبئة عالمية وأوبئة لا يمكن التنبؤ بها. يسبب IAV أمراض الجهاز التنفسي البشرية ، والأنفلونزا ، والمعروفة باسم "الأنفلونزا". الأنفلونزا مرض حاد يؤدي إلى تحريض الاستجابات المناعية الفطرية المؤيدة والمضادة للالتهابات وموت الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي البشري. تخضع كلتا العمليتين لظاهرة تسمى موت الخلايا المبرمج1. يتم تحفيز إشارات موت الخلايا المبرمج بمجرد أن تستشعر مستقبلات التعرف على مسببات الأمراض المختلفة جزيئات الفيروس الواردة في الخلايا المضيفة. هذا يؤدي إلى برمجة موت الخلايا المصابة والإشارة إلى الخلايا السليمة المجاورة من خلال ثلاثة مسارات ....
تم الحصول على الموافقات التنظيمية من لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة أوتاجو للعمل مع IAV وخلايا الثدييات. تم استخدام كلية مادين داربي للكلاب (MDCK) أو الخلايا الظهارية السنخية الرئوية البشرية A549 والأنواع الفرعية IAV H1N1 للدراسة الحالية. نمت IAV في بيض الدجاج ، كما هو موضح في مكان آخر
العلاج مع مثبطات كاسباز 3
لقد تم اكتشاف أن الكورتاكتين المضيف ، HDAC4 ، و HDAC6 polyptides تخضع للتدهور استجابة لعدوى IAV في كل من خلايا الكلاب (MDCK) والبشرية (A549 ، NHBE)7،8،9. باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه ، تم الكشف عن أن كاسباسات المضيف الت?.......
ثبت أن الفيروسات تصمم العوامل والمسارات المضيفة لصالحها. في المقابل ، تقاوم الخلايا المضيفة ذلك من خلال استخدام استراتيجيات مختلفة. واحدة من هذه الاستراتيجيات هي PANoptosis ، والتي تستخدمها الخلايا المضيفة كاستراتيجية مضادة للفيروسات ضد عدوى الفيروسات. ومع ذلك ، طورت فيروسات مثل IAV استراتيجي.......
يعترف المؤلف بجنيفر تيبر ، وبيلان لي ، وجيسي فان ويسترينين ، وكيفن هارود ، ودا يوان تشين ، وفرجانة أحمد ، وسونيا مروس ، وكينيث يامادا ، وريتشارد ويبي ، وموارد BEI (NIAID) ، ومجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا ، وصندوق موريس وفيليس بايكل (نيوزيلندا) ، و HS و JC Anderson Trust (دنيدن) ، وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة وكلية العلوم الطبية الحيوية (جامعة أوتاجو).
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved