Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Influenza A-virus (IAV) infektion aktiverer caspaserne, der spalter vært og virale proteiner, som igen har pro- og antivirale funktioner. Ved at anvende hæmmere, RNA-interferens, stedrettet mutagenese og western blotting og RT-qPCR-teknikker blev caspaser i inficerede pattedyrceller, der spalter værtscortactin og histondeacetylaser, identificeret.
Caspases, en familie af cysteinproteaser, orkestrerer programmeret celledød som reaktion på forskellige stimuli, herunder mikrobielle infektioner. Oprindeligt beskrevet at forekomme ved apoptose, er programmeret celledød nu kendt for at omfatte tre sammenkoblede veje: pyroptose, apoptose og nekroptose, sammen opfundet som en proces, PANoptose. Indflydelse En virus (IAV) infektion inducerer PANoptose i pattedyrceller ved at inducere aktivering af forskellige caspaser, som igen spalter forskellige værts- såvel som virale proteiner, hvilket fører til processer som aktivering af værtsmedfødt antiviralt respons eller nedbrydning af antagonistiske værtsproteiner. I denne henseende er caspase 3-medieret spaltning af værtscortactin, histon deacetylase 4 (HDAC4) og histon deacetylase 6 (HDAC6) blevet opdaget i både dyre- og humane epitelceller som reaktion på IAV-infektionen. For at demonstrere dette blev hæmmere, RNA-interferens og stedrettet mutagenese anvendt, og efterfølgende blev spaltningen eller modstanden mod spaltning og genopretning af cortactin, HDAC4 og HDAC6 polypeptider målt ved western blotting. Disse metoder danner sammen med RT-qPCR en enkel, men effektiv strategi til at identificere værten såvel som virale proteiner, der gennemgår caspasemedieret spaltning under en infektion med IAV eller andre humane og animalske vira. Den foreliggende protokol uddyber de repræsentative resultater af denne strategi, og måderne til at gøre den mere effektiv diskuteres også.
Influenza A-virus (IAV) er det prototypiske medlem af Orthomyxoviridae-familien og er kendt for at forårsage globale epidemier og uforudsigelige pandemier. IAV forårsager human respiratorisk sygdom, influenza, almindeligvis kendt som "influenza". Influenza er en akut sygdom, der resulterer i induktion af værtspro- og antiinflammatoriske medfødte immunresponser og død af epitelceller i det menneskelige luftveje. Begge processer styres af et fænomen kaldet programmeret celledød1. Signaleringen for programmeret celledød induceres, så snart forskellige patogengenkendelsesreceptorer registrerer de indkommende viruspartikler i værtsceller. D....
Lovgivningsmæssige godkendelser blev opnået fra University of Otago Institutional Biological Safety Committee til at arbejde med IAV og pattedyrceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humane lunge alveolære epitel A549 celler og IAV H1N1 undertyper blev anvendt til denne undersøgelse. IAV blev dyrket i hønseæg, som beskrevet andetsteds17. Sterile og aseptiske tilstande blev brugt til at arbejde med pattedyrceller, og et biosikkerhedsniveau 2 (eller fysisk indeslutning 2) anlæg og kla.......
Behandling med caspase 3-hæmmer
Det er blevet opdaget, at værtscortactin, HDAC4 og HDAC6 polypeptider gennemgår nedbrydning som reaktion på IAV-infektion i både hunde (MDCK) og humane (A549, NHBE) celler 7,8,9. Ved at bruge ovenstående metoder blev det afdækket, at IAV-inducerede værtscaspaser, især caspase 3, forårsager deres nedbrydning 7,8,9
Det er fastslået, at vira skræddersyr værtsfaktorer og veje til deres fordel. Til gengæld modstår værtscellerne det ved at anvende forskellige strategier. En af disse strategier er PANoptose, som værtsceller bruger som en antiviral strategi mod virusinfektioner. Imidlertid har vira som IAV udviklet deres egne strategier til at imødegå PANoptose og udnytte det til deres fordel 1,3,6. Dette samspil involverer spaltning af.......
Forfatteren anerkender Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice og Phyllis Paykel Trust (New Zealand), HS og J.C. Anderson Trust (Dunedin) og Institut for Mikrobiologi og Immunologi og School of Biomedical Sciences (University of Otago).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved