Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
L’infection par le virus de la grippe A (IAV) active les caspases qui clivent les protéines de l’hôte et les protéines virales, qui, à leur tour, ont des fonctions provirales et antivirales. En utilisant des inhibiteurs, l’interférence ARN, la mutagénèse dirigée et des techniques de transfert Western et de RT-qPCR, les caspases dans les cellules de mammifères infectées qui clivent la cortactine de l’hôte et les histone désacétylases ont été identifiées.
Les caspases, une famille de cystéines protéases, orchestrent la mort cellulaire programmée en réponse à divers stimuli, y compris les infections microbiennes. Initialement décrite comme se produisant par apoptose, la mort cellulaire programmée est maintenant connue pour englober trois voies interconnectées: la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose, inventées ensemble comme un seul processus, PANoptosis. L’infection virale Influence A (IAV) induit une panoptique dans les cellules de mammifères en induisant l’activation de différentes caspases, qui, à leur tour, clivent diverses protéines hôtes et virales, conduisant à des processus tels que l’activation de la réponse antivirale innée de l’hôte ou la dégradation des protéines antagonistes de l’hôte. À cet égard, le clivage médié par la caspase 3 de la cortactine de l’hôte, de l’histone désacétylase 4 (HDAC4) et de l’histone désacétylase 6 (HDAC6) a été découvert dans des cellules épithéliales animales et humaines en réponse à l’infection par le VIA. Pour démontrer cela, des inhibiteurs, des interférences ARN et une mutagénèse dirigée ont été utilisés et, par la suite, le clivage ou la résistance au clivage et la récupération des polypeptides cortactin, HDAC4 et HDAC6 ont été mesurés par transfert Western. Ces méthodes, associées à la RT-qPCR, constituent une stratégie simple mais efficace pour identifier l’hôte ainsi que les protéines virales subissant un clivage médié par la caspase lors d’une infection par le virus IAV ou d’autres virus humains et animaux. Le présent protocole élabore les résultats représentatifs de cette stratégie, et les moyens de la rendre plus efficace sont également discutés.
Le virus de la grippe A (IAV) est le membre prototypique de la famille des Orthomyxoviridae et est connu pour causer des épidémies mondiales et des pandémies imprévisibles. L’IAV provoque une maladie respiratoire humaine, la grippe, communément appelée « grippe ». La grippe est une maladie aiguë qui entraîne l’induction de réponses immunitaires innées pro et anti-inflammatoires de l’hôte et la mort des cellules épithéliales dans les voies respiratoires humaines. Les deux processus sont régis par un phénomène appelé mort cellulaire programmée1. La signalisation de la mort cellulaire programmée est induite dès que divers récepteurs de re....
Les approbations réglementaires ont été obtenues du comité institutionnel de sécurité biologique de l’Université d’Otago pour travailler avec l’IAV et les cellules de mammifères. Les cellules A549 alvéolaires alvéolaires du rein canin Madin-Darby (MDCK) ou du poumon humain et les sous-types IAV H1N1 ont été utilisés pour la présente étude. IAV a été cultivé dans des œufs de poule, comme décrit ailleurs17. Des conditions stériles et aseptiques ont été utilisées pour tr.......
Traitement par inhibiteur de la caspase 3
Il a été découvert que les polypeptides de cortactine, HDAC4 et HDAC6 de l’hôte subissent une dégradation en réponse à l’infection par le VAI dans les cellules canines (MDCK) et humaines (A549, NHBE) 7,8,9. En utilisant les approches ci-dessus, il a été découvert que les caspases hôtes induites par l’IAV, en particulier les caspases 3, provoquent leur.......
Il est établi que les virus adaptent les facteurs et les voies de l’hôte à leur avantage. À leur tour, les cellules hôtes résistent à cela en employant diverses stratégies. L’une de ces stratégies est PANoptosis, que les cellules hôtes utilisent comme stratégie antivirale contre les infections virales. Cependant, des virus comme IAV ont développé leurs propres stratégies pour contrer PANoptosis et l’exploiter à leur avantage 1,3,6
L’auteur remercie Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, le BEI Resources (NIAID), le Health Research Council of New Zealand, le Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nouvelle-Zélande), le H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), le Département de microbiologie et d’immunologie et l’École des sciences biomédicales (Université d’Otago).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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