Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Die Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) aktiviert die Caspasen, die Wirts- und Virusproteine spalten, die wiederum pro- und antivirale Funktionen haben. Durch den Einsatz von Inhibitoren, RNA-Interferenz, ortsgerichteter Mutagenese und Western Blotting und RT-qPCR-Techniken wurden Caspasen in infizierten Säugetierzellen identifiziert, die Wirtscortactin- und Histon-Deacetylasen spalten.
Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, orchestrieren den programmierten Zelltod als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich mikrobieller Infektionen. Ursprünglich als Apoptose beschrieben, ist heute bekannt, dass der programmierte Zelltod drei miteinander verbundene Wege umfasst: Pyroptose, Apoptose und Nekroptose, die zusammen als ein Prozess, PANoptose, bezeichnet werden. Einfluss Eine Virusinfektion (IAV) induziert PANoptose in Säugetierzellen, indem sie die Aktivierung verschiedener Caspasen induziert, die wiederum verschiedene Wirts- und virale Proteine spalten, was zu Prozessen wie der Aktivierung der angeborenen antiviralen Antwort des Wirts oder dem Abbau antagonistischer Wirtsproteine führt. In dieser Hinsicht wurde eine Caspase-3-vermittelte Spaltung von Wirtscortactin, Histon-Deacetylase 4 (HDAC4) und Histon-Deacetylase 6 (HDAC6) sowohl in tierischen als auch in menschlichen Epithelzellen als Reaktion auf die IAV-Infektion entdeckt. Um dies zu demonstrieren, wurden Inhibitoren, RNA-Interferenz und ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt, und anschließend wurden die Spaltung oder Resistenz gegen Spaltung und die Erholung von Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptiden durch Western Blotting gemessen. Diese Methoden bilden in Verbindung mit der RT-qPCR eine einfache, aber effektive Strategie, um den Wirt sowie virale Proteine zu identifizieren, die während einer Infektion mit IAV oder anderen menschlichen und tierischen Viren eine Caspase-vermittelte Spaltung durchlaufen. Das vorliegende Protokoll erarbeitet die repräsentativen Ergebnisse dieser Strategie, und es werden auch die Möglichkeiten diskutiert, sie wirksamer zu gestalten.
Das Influenza-A-Virus (IAV) ist das prototypische Mitglied der Familie der Orthomyxoviridae und ist dafür bekannt, globale Epidemien und unvorhersehbare Pandemien zu verursachen. IAV verursacht menschliche Atemwegserkrankungen, Influenza, allgemein bekannt als "Grippe". Die Grippe ist eine akute Erkrankung, die zur Induktion wirtspro- und entzündungshemmender angeborener Immunantworten und zum Absterben von Epithelzellen in den menschlichen Atemwegen führt. Beide Prozesse werden von einem Phänomen gesteuert, das als programmierter Zelltodbezeichnet wird 1. Die Signalisierung für den programmierten Zelltod wird induziert, sobald verschi....
Die behördlichen Genehmigungen wurden vom University of Otago Institutional Biological Safety Committee für die Arbeit mit IAV- und Säugetierzellen eingeholt. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) oder humane alveoläre Lungenepithelzellen A549 und IAV H1N1 Subtypen wurden für die vorliegende Studie verwendet. IAV wurde in Hühnereiern gezüchtet, wie an anderer Stellebeschrieben 17. Für die Arbeit mit Säugetierzellen wurden sterile und aseptische Bedingungen verwendet, und eine Biosicherheitsein.......
Behandlung mit Caspase-3-Hemmer
Es wurde entdeckt, dass Wirts-Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptide als Reaktion auf eine IAV-Infektion sowohl in Hunde- (MDCK) als auch in menschlichen (A549, NHBE) Zellen abgebaut werden 7,8,9. Mit den oben genannten Ansätzen wurde aufgedeckt, dass IAV-induzierte Wirtskaspasen, insbesondere Caspase 3, deren Abbauverursachen 7,8,9.
Es ist erwiesen, dass Viren die Wirtsfaktoren und -wege zu ihrem Vorteil anpassen. Die Wirtszellen wiederum wehren sich dagegen, indem sie verschiedene Strategien anwenden. Eine dieser Strategien ist die PANoptose, die Wirtszellen als antivirale Strategie gegen Virusinfektionen einsetzen. Viren wie IAV haben jedoch ihre eigenen Strategien entwickelt, um der PANoptose entgegenzuwirken und sie zu ihrem Vorteil auszunutzen 1,3,6. D.......
Der Autor dankt Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, den BEI Resources (NIAID), dem Health Research Council of New Zealand, dem Maurice and Phyllis Paykel Trust (Neuseeland), dem H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin) und dem Department of Microbiology and Immunology und der School of Biomedical Sciences (University of Otago).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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