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Immunology and Infection

A型インフルエンザウイルス感染時にタンパク質を切断するカスパーゼとそのモチーフの同定

Published: July 21st, 2022

DOI:

10.3791/64189

1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

インフルエンザAウイルス(IAV)感染は、宿主およびウイルスタンパク質を切断するカスパーゼを活性化し、次に、プロウイルスおよび抗ウイルス機能を有する。阻害剤、RNA干渉、部位特異的突然変異誘発、およびウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR技術を採用することにより、宿主コルタクチンおよびヒストンデアセチラーゼを切断する感染哺乳類細胞におけるカスパーゼが同定された。

システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、微生物感染を含むさまざまな刺激に応答してプログラムされた細胞死を調整します。当初はアポトーシスによって起こると説明されていましたが、プログラムされた細胞死は、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの3つの相互接続された経路を含むことが現在知られており、一緒になって1つのプロセスであるパントーシスとして造られています。インフルエンスAウイルス(IAV)感染は、さまざまなカスパーゼの活性化を誘導することにより哺乳類細胞のパンノプトーシスを誘導し、さまざまな宿主およびウイルスタンパク質を切断し、宿主の自然抗ウイルス応答の活性化や拮抗宿主タンパク質の分解などのプロセスを引き起こします。これに関して、宿主コルタクチンのカスパーゼ3媒介切断、ヒストンデアセチラーゼ4(HDAC4)、およびヒストンデアセチラーゼ6(HDAC6)が、IAV感染に応答して動物およびヒト上皮細胞の両方で発見されている。これを実証するために、阻害剤、RNA干渉、および部位特異的突然変異誘発法を使用し、続いて、コルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドの切断または切断に対する耐性および回収をウェスタンブロッティングによって測定しました。これらの方法は、RT-qPCRと組み合わせて、IAVまたは他のヒトおよび動物ウイルスの感染中にカスパーゼ媒介切断を受けている宿主およびウイルスタンパク質を同定するための単純でありながら効果的な戦略を形成します。本議定書は、この戦略の代表的な結果を詳述し、それをより効果的にする方法についても議論する。

インフルエンザAウイルス(IAV)は、 オルトミクソウイルス科 のプロトタイプメンバーであり、世界的な流行と予測不可能なパンデミックを引き起こすことが知られています。IAVは、一般に「インフルエンザ」として知られているヒト呼吸器疾患、インフルエンザを引き起こします。インフルエンザは、宿主の炎症誘発性および抗炎症性の自然免疫応答の誘導とヒト気道の上皮細胞の死をもたらす急性疾患です。どちらのプロセスも、プログラムされた細胞死と呼ばれる現象によって支配されています1。プログラムされた細胞死のシグナル伝達は、さまざまな病原体認識受容体が宿主細胞に入ってくるウイルス粒子を感知するとすぐに誘導されます。これは、感染した細胞の死のプログラミングと、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスと呼ばれる3つの相互接続された経路による隣接する健康な細胞へのシグナル伝達につながります-最近、1つのプロセスとして造られました、 PANoptosis1。

PANoptosisは、誘導から実行までの多くの宿主およびウイルスタンパク質のタンパク質分解プロセスを含みます。このようなタンパク質のプロセシングは、主にカスパーゼ1,2と呼ばれるシステインプロテアーゼのファミリーによ....

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オタゴ大学機関生物学的安全委員会から、IAVおよび哺乳類細胞を扱うための規制当局の承認が得られました。マディンダービーイヌ腎臓(MDCK)またはヒト肺胞上皮A549細胞およびIAV H1N1サブタイプが本研究に使用されました。IAVは、他の場所に記載されているように、鶏の卵で育てられました17。無菌および無菌条件を使用して哺乳類細胞を処理し、バイオセーフティレベル2(ま.......

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カスパーゼ3阻害剤による治療
宿主のコルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドは、イヌ(MDCK)細胞とヒト(A549、NHBE)細胞の両方でIAV感染に応答して分解を受けることが発見されています7、8、9。上記のアプローチを使用することにより、IAV誘発宿主カスパーゼ、特にカスパーゼ3がそれらの分解を引き起こ?.......

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ウイルスは宿主の要因と経路をその利益に合わせて調整することが確立されています。次に、宿主細胞はさまざまな戦略を採用することによってそれに抵抗します。それらの戦略の1つは、宿主細胞がウイルス感染に対する抗ウイルス戦略として使用するパンノプトーシスです。しかし、IAVのようなウイルスは、パンノプトーシスに対抗し、それを有利に利用するために独自の戦略を進化させ.......

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NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

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