JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 단백질을 절단하는 카스파아제와 그 모티프 식별

Published: July 21st, 2022

DOI:

10.3791/64189

1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염은 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하는 카스파 제를 활성화시켜 프로 바이러스 및 항 바이러스 기능을 갖습니다. 억제제, RNA 간섭, 부위 지향 돌연변이 유발, 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 기술을 사용하여 숙주 코르탁틴 및 히스톤 탈아세틸라제를 절단하는 감염된 포유류 세포의 카스파제를 식별했습니다.

시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 미생물 감염을 포함한 다양한 자극에 반응하여 프로그램된 세포 사멸을 조정합니다. 처음에는 세포 사멸에 의해 발생하는 것으로 설명 된 프로그램 된 세포 사멸은 이제 세 가지 상호 연결된 경로, 즉 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사 증을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 함께 하나의 과정 인 PANoptosis로 만들어졌습니다. 영향 바이러스(IAV) 감염은 다양한 카스파제의 활성화를 유도하여 포유류 세포에서 PANoptosis를 유도하고, 이는 차례로 다양한 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하여 숙주 선천적 항바이러스 반응의 활성화 또는 길항성 숙주 단백질의 분해와 같은 과정을 유도합니다. 이와 관련하여, 숙주 코르탁틴, 히스톤 탈아세틸라제 4 (HDAC4), 및 히스톤 탈아세틸라제 6 (HDAC6)의 카스파제 3-매개 절단이 IAV 감염에 반응하여 동물 및 인간 상피 세포 모두에서 발견되었다. 이를 입증하기 위해 억제제, RNA 간섭 및 부위 지시 돌연변이 유발을 사용했으며, 이어서 절단에 대한 절단 또는 저항성 및 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드의 회복을 웨스턴 블롯팅으로 측정했습니다. 이러한 방법은 RT-qPCR과 함께 IAV 또는 기타 인간 및 동물 바이러스의 감염 중에 카스파제 매개 절단을 겪는 바이러스 단백질뿐만 아니라 숙주를 식별하는 간단하면서도 효과적인 전략을 형성합니다. 본 프로토콜은이 전략의 대표적인 결과를 자세히 설명하고이를 더 효과적으로 만드는 방법도 논의합니다.

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 Orthomyxoviridae 계열의 프로토 타입 구성원이며 전 세계적으로 전염병과 예측할 수없는 전염병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. IAV는 일반적으로 "독감"으로 알려진 인간 호흡기 질환, 인플루엔자를 유발합니다. 상기 독감은 숙주 전염증성 및 항염증성 선천성 면역 반응의 유도 및 인간 호흡기에서 상피 세포의 사멸을 초래하는 급성 질환이다. 두 과정 모두 프로그램 된 세포 사멸1이라는 현상에 의해 지배됩니다. 프로그램된 세포 사멸에 대한 신호 전달은 다양한 병원체 인식 수용체가 숙주 세포에서 들어오는 바이러스 입자를 감지하는 즉시 유도됩니다. 이것은 감염된 세포의 죽음을 프로그래밍하고 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사라고 불리는 세 가지 상호 연결된 경로에 의해 인접한 건강한 세포에 신호를 보냅니다 - 최근에는 하나의 과정 인 PANoptosis1로 만들어졌습니다.

PANoptosis는 유도에서 실행까지 많은 숙주 및 바이러스 단백질의 단백질 분해 처리를 포함합니다. 이러한 단백질 처리는 주로 카스파제 1,2

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAV 및 포유류 세포와 협력하기 위해 오타고 대학 기관 생물 안전 위원회로부터 규제 승인을 받았습니다. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 또는 인간 폐 폐포 상피 A549 세포 및 IAV H1N1 아형을 본 연구에 사용하였다. IAV는 다른 곳에서 설명한 바와 같이 닭고기 알에서 성장하였다17. 무균 및 무균 조건은 포유류 세포와 함께 작업하는 데 사용되었으며 생물 안전 레벨 2 (또는 물리적 격리 2) 시.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

카스파 아제 3 억제제로 치료
숙주 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드는 개 (MDCK) 및 인간 (A549, NHBE) 세포 7,8,9 모두에서 IAV 감염에 반응하여 분해되는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법을 사용함으로써, IAV-유도된 숙주 카스파제, 특히 카스파아제 3이 이들의 분해 7,8,9

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

바이러스는 숙주 요인과 경로를 자신의 이익에 맞게 조정한다는 것이 입증되었습니다. 차례로, 숙주 세포는 다양한 전략을 사용함으로써 그것에 저항합니다. 이러한 전략 중 하나는 숙주 세포가 바이러스 감염에 대한 항바이러스 전략으로 사용하는 PANoptosis입니다. 그러나 IAV와 같은 바이러스는 PANoptosis에 대응하고이를 유리하게 악용하기 위해 자체 전략을 발전시켰습니다1,3,6.<.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

저자는 Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (뉴질랜드), HS and J.C. Anderson Trust (더니든), 미생물학 및 면역학과 및 생물 의학 학교 (University of Otago).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved