Identifisere Caspases og deres motiver som spalter proteiner under influensa A-virusinfeksjon

Influensa A-virus (IAV) infeksjon aktiverer caspases som spalter vert og virale proteiner, som igjen har pro- og antivirale funksjoner. Ved å bruke inhibitorer, RNA-interferens, stedsrettet mutagenese og western blotting og RT-qPCR-teknikker, ble caspases i infiserte pattedyrceller som spalter vertskortaktin og histondeacetylaser identifisert.

Caspases, en familie av cysteinproteaser, orkestrerer programmert celledød som respons på ulike stimuli, inkludert mikrobielle infeksjoner. Opprinnelig beskrevet å forekomme ved apoptose, er programmert celledød nå kjent for å omfatte tre sammenhengende veier: pyroptose, apoptose og nekroptose, sammen laget som en prosess, PANoptosis. Påvirkning Et virus (IAV) infeksjon induserer PANoptosis i pattedyrceller ved å indusere aktivering av forskjellige caspases, som igjen spalter forskjellige vert så vel som virale proteiner, noe som fører til prosesser som aktivering av vertens medfødte antivirale respons eller nedbrytning av antagonistiske vertsproteiner. I denne forbindelse har caspase 3-mediert spaltning av vertskortaktin, histon deacetylase 4 (HDAC4) og histon deacetylase 6 (HDAC6) blitt oppdaget i både dyre- og humane epitelceller som respons på IAV-infeksjonen. For å demonstrere dette ble inhibitorer, RNA-interferens og stedsrettet mutagenese brukt, og deretter ble spaltning eller motstand mot spaltning og gjenvinning av kortaktin-, HDAC4- og HDAC6-polypeptider målt ved vestlig blotting. Disse metodene, sammen med RT-qPCR, danner en enkel, men effektiv strategi for å identifisere verten så vel som virale proteiner som gjennomgår caspase-mediert spaltning under en infeksjon av IAV eller andre humane og animalske virus. Denne protokollen utdyper de representative resultatene av denne strategien, og måtene å gjøre den mer effektiv diskuteres også.

Influensa A-virus (IAV) er det prototypiske medlemmet av Orthomyxoviridae-familien og er kjent for å forårsake globale epidemier og uforutsigbare pandemier. IAV forårsaker menneskelig luftveissykdom, influensa, kjent som "influensa". Influensa er en akutt sykdom som resulterer i induksjon av vertspro- og antiinflammatoriske medfødte immunresponser og død av epitelceller i menneskets luftveier. Begge prosessene styres av et fenomen som kalles programmert celledød¹. Signaleringen for programmert celledød induseres så snart forskjellige patogengjenkjenningsreseptorer fornemmer de innkommende viruspartiklene i vertsceller. Dette fører til ....

Regulatoriske godkjenninger ble innhentet fra University of Otago Institutional Biological Safety Committee for å jobbe med IAV og pattedyrceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humane lungealveolære epitel A549-celler og IAV H1N1-subtyper ble brukt til denne studien. IAV ble dyrket i kyllingegg, som beskrevet andre steder¹⁷. Sterile og aseptiske forhold ble brukt til å arbeide med pattedyrceller, og et biosikkerhetsnivå 2 (eller fysisk inneslutning 2) anlegg og klasse II biosikkerhets.......

Behandling med caspase 3-hemmer
Det har blitt oppdaget at verts kortaktin, HDAC4 og HDAC6 polypeptider gjennomgår nedbrytning som svar på IAV-infeksjon i både hund (MDCK) og humane (A549, NHBE) celler ^7,8,9. Ved å bruke de ovennevnte tilnærmingene ble det avdekket at IAV-induserte vertskaspaser, spesielt caspase 3, forårsaker nedbrytning ^7,8,9

Det er fastslått at virus skreddersyr vertsfaktorene og veiene til deres fordel. I sin tur motstår vertscellene det ved å bruke ulike strategier. En av disse strategiene er PANoptosis, som vertsceller bruker som en antiviral strategi mot virusinfeksjoner. Imidlertid har virus som IAV utviklet sine egne strategier for å motvirke PANoptose og utnytte det til deres fordel ^1,3,6. Dette samspillet innebærer spaltning av forskjel.......

Forfatteren anerkjenner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice og Phyllis Paykel Trust (New Zealand), HS og JC Anderson Trust (Dunedin), og Institutt for mikrobiologi og immunologi og School of Biomedical Sciences (University of Otago).