Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
A infecção pelo vírus da gripe A (IAV) ativa as caspases que clivam o hospedeiro e as proteínas virais, que, por sua vez, têm funções pró e antivirais. Empregando-se inibidores, interferência de RNA, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de western blotting e RT-qPCR, foram identificadas caspases em células de mamíferos infectadas que clivam a cortactina do hospedeiro e as histonas desacetilases.
Caspases, uma família de proteases de cisteína, orquestram a morte celular programada em resposta a vários estímulos, incluindo infecções microbianas. Inicialmente descrita como ocorrendo por apoptose, a morte celular programada é agora conhecida por abranger três vias interconectadas: piroptose, apoptose e necroptose, cunhadas juntas como um processo, PANoptose. Influência A infecção por vírus (IAV) induz a PANoptose em células de mamíferos, induzindo a ativação de diferentes caspases, que, por sua vez, clivam várias proteínas hospedeiras e virais, levando a processos como a ativação da resposta antiviral inata do hospedeiro ou a degradação de proteínas antagônicas do hospedeiro. A este respeito, a clivagem mediada pela caspase 3 da cortactina do hospedeiro, histona desacetilase 4 (HDAC4) e histona desacetilase 6 (HDAC6) foi descoberta em células epiteliais animais e humanas em resposta à infecção por IAV. Para demonstrar isso, foram empregados inibidores, interferência de RNA e mutagênese sítio-dirigida e, posteriormente, a clivagem ou resistência à clivagem e a recuperação dos polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram medidas por western blotting. Esses métodos, em conjunto com a RT-qPCR, formam uma estratégia simples, mas eficaz, para identificar o hospedeiro, bem como as proteínas virais submetidas à clivagem mediada pela caspase durante uma infecção por IAV ou outros vírus humanos e animais. O presente protocolo elabora os resultados representativos dessa estratégia, e também são discutidas as formas de torná-la mais eficaz.
O vírus da gripe A (IAV) é o membro prototípico da família Orthomyxoviridae e é conhecido por causar epidemias globais e pandemias imprevisíveis. IAV causa doença respiratória humana, gripe, comumente conhecida como "gripe". A gripe é uma doença aguda que resulta na indução de respostas imunes inatas pró e anti-inflamatórias do hospedeiro e na morte de células epiteliais no trato respiratório humano. Ambos os processos são regidos por um fenômeno chamado morte celular programada1. A sinalização para a morte celular programada é induzida assim que vários receptores de reconhecimento de patógenos detectam as partículas virais recebidas n....
As aprovações regulatórias foram obtidas do Comitê de Segurança Biológica Institucional da Universidade de Otago para trabalhar com o IAV e as células de mamíferos. Rim Canino de Madin-Darby (MDCK) ou células A549 epiteliais alveolares pulmonares humanas e subtipos IAV H1N1 foram utilizados para o presente estudo. A VAI foi cultivada em ovos de galinha, conforme descrito em outroslugares 17. Condições estéreis e assépticas foram usadas para trabalhar com células de mamíferos, e uma .......
Tratamento com inibidor da caspase 3
Verificou-se que os polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 do hospedeiro sofrem degradação em resposta à infecção por IAV em células caninas (MDCK) e humanas (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizando as abordagens acima, descobriu-se que as caspases do hospedeiro induzidas por IAV, particularmente a caspase 3, causam sua degradação .......
Está estabelecido que os vírus adaptam os fatores e vias do hospedeiro para seu benefício. Por sua vez, as células hospedeiras resistem a isso, empregando várias estratégias. Uma dessas estratégias é a PANoptosis, que as células hospedeiras usam como estratégia antiviral contra infecções por vírus. No entanto, vírus como o IAV desenvolveram suas próprias estratégias para combater a PANoptose e explorá-la a seu favor 1,3,6........
O autor reconhece Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), o Health Research Council of New Zealand, o Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nova Zelândia), o H.S. e J.C. Anderson Trust (Dunedin) e o Departamento de Microbiologia e Imunologia e Escola de Ciências Biomédicas (Universidade de Otago).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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