Identifiera kaspaser och deras motiv som klyver proteiner under influensa A-virusinfektion

Influensa A-virus (IAV) -infektion aktiverar de caspaser som klyver värd- och virusproteiner, som i sin tur har pro- och antivirala funktioner. Genom att använda hämmare, RNA-interferens, platsriktad mutagenes och western blotting- och RT-qPCR-tekniker identifierades kaspaser i infekterade däggdjursceller som klyver värdkortaktin och histondeacetylaser.

Caspaser, en familj av cysteinproteaser, orkestrerar programmerad celldöd som svar på olika stimuli, inklusive mikrobiella infektioner. Ursprungligen beskrivet att inträffa genom apoptos, är programmerad celldöd nu känd för att omfatta tre sammankopplade vägar: pyroptos, apoptos och nekroptos, tillsammans myntade som en process, PANoptosis. Påverkan A-virusinfektion (IAV) inducerar PANoptos i däggdjursceller genom att inducera aktivering av olika caspaser, som i sin tur klyver olika värd- såväl som virala proteiner, vilket leder till processer som aktivering av värdens medfödda antivirala svar eller nedbrytning av antagonistiska värdproteiner. I detta avseende har kaspas-3-medierad klyvning av värdkortatin, histondeacetylas 4 (HDAC4) och histondeacetylas 6 (HDAC6) upptäckts i både djur- och humanepitelceller som svar på IAV-infektionen. För att demonstrera detta användes hämmare, RNA-interferens och platsriktad mutagenes, och därefter mättes klyvningen eller motståndet mot klyvning och återvinning av kortattin-, HDAC4- och HDAC6-polypeptider med western blotting. Dessa metoder, i kombination med RT-qPCR, bildar en enkel men effektiv strategi för att identifiera värden såväl som virala proteiner som genomgår kaspasmedierad klyvning under en infektion av IAV eller andra mänskliga och djurvirus. I detta protokoll utvecklas de representativa resultaten av denna strategi, och sätten att göra den mer effektiv diskuteras också.

Influensa A-virus (IAV) är den prototypiska medlemmen i familjen Orthomyxoviridae och är känd för att orsaka globala epidemier och oförutsägbara pandemier. IAV orsakar mänsklig andningssjukdom, influensa, allmänt känd som "influensa". Influensan är en akut sjukdom som resulterar i induktion av värdpro- och antiinflammatoriska medfödda immunsvar och död av epitelceller i människans luftvägar. Båda processerna styrs av ett fenomen som kallas programmerad celldöd¹. Signaleringen för programmerad celldöd induceras så snart olika patogenigenkänningsreceptorer känner av de inkommande viruspartiklarna i värdceller. Detta leder till programmer....

Myndighetsgodkännanden erhölls från University of Otago Institutional Biological Safety Committee för att arbeta med IAV- och däggdjursceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humana lungalveolära epitelceller A549 och IAV H1N1-subtyper användes för denna studie. IAV odlades i kycklingägg, som beskrivs på andra ställen¹⁷. Sterila och aseptiska förhållanden användes för att arbeta med däggdjursceller, och en biosäkerhetsnivå 2 (eller fysisk inneslutning 2) och klass II bios?.......

Behandling med caspase 3-hämmare
Det har upptäckts att värdkortatin, HDAC4 och HDAC6 polypeptider genomgår nedbrytning som svar på IAV-infektion i både hund (MDCK) och humana (A549, NHBE) celler ^7,8,9. Genom att använda ovanstående metoder avslöjades att IAV-inducerade värdkaspaser, särskilt caspase 3, orsakar deras nedbrytning ^7,8,9.

Det är uppenbart att virus skräddarsyr värdfaktorerna och vägarna till deras fördel. I sin tur motstår värdcellerna det genom att använda olika strategier. En av dessa strategier är PANoptosis, som värdceller använder som en antiviral strategi mot virusinfektioner. Virus som IAV har dock utvecklat sina egna strategier för att motverka PANoptos och utnyttja det till sin fördel ^1,3,6. Detta samspel involverar klyvning.......

Författaren erkänner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice och Phyllis Paykel Trust (Nya Zeeland), H.S. och J.C. Anderson Trust (Dunedin) och Institutionen för mikrobiologi och immunologi och School of Biomedical Sciences (University of Otago).