JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi

Published: July 21st, 2022

DOI:

10.3791/64189

1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.

Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, mikrobiyal enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak programlanmış hücre ölümünü düzenler. Başlangıçta apoptoz ile ortaya çıktığı tanımlanan programlanmış hücre ölümünün şimdi birbirine bağlı üç yolu kapsadığı bilinmektedir: pirotoz, apoptoz ve nekroptoz, birlikte tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz. Etki Bir virüs (IAV) enfeksiyonu, farklı kaspazların aktivasyonunu indükleyerek memeli hücrelerinde PANoptozu indükler, bu da çeşitli konakçıların yanı sıra viral proteinleri de parçalara ayırır ve konakçının doğuştan gelen antiviral yanıtının aktivasyonu veya antagonistik konakçı proteinlerinin bozulması gibi süreçlere yol açar. Bu bağlamda, IAV enfeksiyonuna yanıt olarak hem hayvan hem de insan epitel hücrelerinde konakçı kortaktin, histon deasetilaz 4 (HDAC4) ve histon deasetilaz 6'nın (HDAC6) kaspaz 3 aracılı bölünmesi keşfedilmiştir. Bunu göstermek için, inhibitörler, RNA girişimi ve bölgeye yönelik mutagenez kullanıldı ve daha sonra, bölünmeye karşı bölünme veya direnç ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin geri kazanımı batı lekelenmesi ile ölçüldü. Bu yöntemler, RT-qPCR ile birlikte, IAV veya diğer insan ve hayvan virüslerinin enfeksiyonu sırasında kaspaz aracılı bölünmeye maruz kalan viral proteinlerin yanı sıra konakçıyı tanımlamak için basit ama etkili bir strateji oluşturur. Mevcut protokol, bu stratejinin temsili sonuçlarını detaylandırmakta ve daha etkili hale getirmenin yolları da tartışılmaktadır.

İnfluenza A virüsü (IAV), Orthomyxoviridae ailesinin prototipik üyesidir ve küresel salgınlara ve öngörülemeyen pandemilere neden olduğu bilinmektedir. IAV, genellikle "grip" olarak bilinen insan solunum yolu hastalığına, influenzaya neden olur. Grip, konakçı pro- ve anti-inflamatuar doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu ve insan solunum yollarında epitel hücrelerinin ölümü ile sonuçlanan akut bir hastalıktır. Her iki süreç de programlanmış hücre ölümü1 adı verilen bir fenomen tarafından yönetilir. Programlanmış hücre ölümü için sinyalizasyon, çeşitli patojen tanıma reseptörleri konakçı hücrelerde gelen virüs parçacıklarını algıl....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAV ve memeli hücreleriyle çalışmak için Otago Üniversitesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Komitesi'nden düzenleyici onaylar alındı. Bu çalışmada Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya insan akciğer alveoler epitel A549 hücreleri ve IAV H1N1 alt tipleri kullanılmıştır. IAV, başka bir yerde açıklandığı gibi tavuk yumurtasında yetiştirildi17. Memeli hücreleriyle çalışmak için steril ve aseptik koşullar kullanıldı ve IAV alt tipleriyle çalışmak için bir Biyogüve.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi
Konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin hem köpek (MDCK) hem de insan (A549, NHBE) hücrelerinde IAV enfeksiyonuna yanıt olarak bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. Yukarıdaki yaklaşımlar kullanılarak, IAV kaynaklı konak kaspazlarının, özellikle kaspaz 3'ün, 7,8,9

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Virüslerin konakçı faktörleri ve yolları kendi yararlarına göre uyarladıkları tespit edilmiştir. Buna karşılık, konakçı hücreler çeşitli stratejiler kullanarak buna direnirler. Bu stratejilerden biri, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonlarına karşı antiviral bir strateji olarak kullandıkları PANoptozdur. Bununla birlikte, IAV gibi virüsler, PANoptoza karşı koymak ve onu kendi avantajlarına göre kullanmak için kendi stratejilerini geliştirmiştir .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yazar, Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Kaynakları (NIAID), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi, Maurice ve Phyllis Paykel Vakfı (Yeni Zelanda), HS ve J.C. Anderson Trust (Dunedin) ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü ve Biyomedikal Bilimler Okulu'nu (Otago Üniversitesi) kabul ediyor.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved