Mikrofluidikk-assistert selektiv depolarisering av aksonale mitokondrier

Denne protokollen beskriver såing og farging av nevronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene muliggjør selektiv behandling av mitokondrier i aksoner for å analysere deres egenskaper som svar på farmakologiske utfordringer uten å påvirke cellekroppen.

Mitokondrier er de primære leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Mitokondriell dysfunksjon er en vanlig fenotype i mange nevrodegenerative sykdommer. Gitt noen aksoners forseggjorte arkitektur og ekstreme lengde, er det ikke overraskende at mitokondrier i aksoner kan oppleve forskjellige miljøer sammenlignet med deres cellekroppsmodeller. Interessant, dysfunksjon av aksonale mitokondrier går ofte foran effekter på cellekroppen. For å modellere aksonal mitokondriell dysfunksjon in vitro, tillater mikrofluidiske enheter behandling av aksonale mitokondrier uten å påvirke de somale mitokondriene. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene forhindrer diffusjon av molekyler mot gradienten, og muliggjør dermed analyse av mitokondrielle egenskaper som svar på lokale farmakologiske utfordringer i aksoner. Den nåværende protokollen beskriver såing av dissosierte hippocampale nevroner i mikrofluidiske enheter, farging med et membranpotensial følsomt fargestoff, behandling med mitokondrielt toksin og den påfølgende mikroskopiske analysen. Denne allsidige metoden for å studere aksonal biologi kan brukes på mange farmakologiske forstyrrelser og bildeavlesninger, og er egnet for flere neuronale subtyper.

Mitokondrier er de viktigste leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Siden nevronhelse er nært knyttet til mitokondriell funksjon, er det ikke overraskende at dysfunksjonell regulering av disse organellene har vært assosiert med utbruddet av ulike nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons^sykdom. Videre har mitokondriell forgiftning med hell blitt brukt til å modellere Parkinsonske symptomer hos dyr². I både dyremodeller og menneskelig sykdom starter bortfallet av nevroner ved de distale delene^3,4, noe som antyder at akso....

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter fra regjeringen i Øvre Bayern. De primære nevronene ble fremstilt fra E16.5 C57BL/6 museembryoer av begge kjønn etter standardmetoder som tidligere beskrevet⁶.

1. Montering av mikrofluidisk enhet

1. Belegg en seks-brønns glassbunnsvevskulturplate med en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml Poly-D-lysin og 3,4 μg / ml Laminin i PBS (fosfatbufret saltvann) (se .......

Primære hippocampale nevroner ble dyrket i mikrofluidiske enheter i 7-8 dager før mitokondrier ble farget med det membranfølsomme fargestoffet (TMRE) i 25 minutter i begge kanalene. Som vist i figur 2A ga dette homogen farging av mitokondrier på begge sider av mikrogroovene, men det var likevel ikke tilstrekkelig til å likestille fargingen i midten av mikrogroovene. Ved tillegg av antimycin A til aksonal side beholdt somale mitokondrier TMRE-signalet (figur 2B

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å frø og dyrke dissosierte hippocampale nevroner i en mikrofluidisk enhet for å behandle aksonale mitokondrier separat. Nytten av denne tilnærmingen med det membranfølsomme fargestoffet TMRE og den komplekse III-hemmeren Antimycin A (som tidligere demonstrert⁷) er demonstrert her, men denne metoden kan enkelt tilpasses andre mitokondrielle fargestoffer eller genetisk kodede sensorer av mitokondrielle funksjoner som tillater lokale, mikroskop.......

Denne studien ble støttet av German Research Foundation (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.