Селективная деполяризация аксональных митохондрий с помощью микрофлюидики

Настоящий протокол описывает посев и окрашивание нейронных митохондрий в микрофлюидных камерах. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах позволяет селективно обрабатывать митохондрии в аксонах для анализа их свойств в ответ на фармакологические проблемы, не влияя на компартмент клеточного тела.

Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Митохондриальная дисфункция является распространенным фенотипом при многих нейродегенеративных заболеваниях. Учитывая сложную архитектуру некоторых аксонов и их чрезвычайную длину, неудивительно, что митохондрии в аксонах могут испытывать различные среды по сравнению с их аналогами клеточного тела. Интересно, что дисфункция аксональных митохондрий часто предшествует воздействию на организм клетки. Для моделирования аксональной митохондриальной дисфункции in vitro микрофлюидные устройства позволяют лечить аксональные митохондрии, не затрагивая сомальные митохондрии. Градиент псевдоожиженного давления в этих камерах предотвращает диффузию молекул против градиента, что позволяет анализировать свойства митохондрий в ответ на локальные фармакологические проблемы в аксонах. Текущий протокол описывает посев диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидные устройства, окрашивание мембранно-потенциально чувствительным красителем, лечение митохондриальным токсином и последующий микроскопический анализ. Этот универсальный метод изучения аксональной биологии может быть применен ко многим фармакологическим возмущениям и показаниям изображений и подходит для нескольких нейронных подтипов.

Митохондрии являются основными поставщиками АТФ (аденозинтрифосфата) в нейронах. Поскольку здоровье нейронов тесно связано с митохондриальной функцией, неудивительно, что дисфункциональная регуляция этих органелл была связана с началом различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона¹. Кроме того, митохондриальная интоксикация успешно используется для моделирования симптомов паркинсонизма у животных². Как на животных моделях, так и при болезни человека гибель нейронов начинается с дистальных частей ^3,4, намекая на то, чт....

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами правительства Верхней Баварии. Первичные нейроны были получены из эмбрионов мышей дикого типа E16.5 C57BL/6 обоих полов в соответствии со стандартными методами, как^{опи.......}

Первичные нейроны гиппокампа выращивали в микрофлюидных устройствах в течение 7-8 дней, прежде чем митохондрии окрашивали мембранно-чувствительным красителем (TMRE) в течение 25 мин в обоих каналах. Как показано на рисунке 2А, это привело к однородному окрашиванию митохонд?.......

Настоящий протокол описывает способ посева и культивирования диссоциированных нейронов гиппокампа в микрофлюидном устройстве для отдельного лечения аксональных митохондрий. Полезность этого подхода с мембранно-чувствительным красителем TMRE и комплексным ингибитором III Антимицином.......

Это исследование было поддержано Немецким исследовательским фондом (HA 7728/2-1 и EXC2145 Project ID 390857198) и Обществом Макса Планка.