Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

Summary

Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.

Abstract

Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (K_d) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.

Introduction

Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням ^1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела ^3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определен....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.

1. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в одном буфере как для аптамера, так и для лиганда, с тем чтобы избежать выделения тепла, вызванного смешиванием различных буферов из ячейки образца и шприца. Обычно это достигается путем диализа всех материалов в один буфер. Буфер обменивается с помощью протокола, адаптированного из протокола концентратора отсечения молекулярной массы (MWC) 3....

Discussion

Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объек.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5