Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

Резюме

Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.

Аннотация

Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (K_d) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.

Введение

Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням ^1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела ^3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определения сродства аптамеров, включая ITC, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), колориметрическое титрование, микромасштабный термофорез (MST) и биослойную интерферометрию (BLI). Среди них ITC является одним из новейших методов определения термодинамической и кинетической ассоциации двух молекул в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием ^6,7. В отличие от других методов, ITC может предложить сродство связывания, несколько сайтов связывания, а также термодинамическую и кинетическую ассоциацию (рисунок 1A). Из этих начальных параметров изменения свободной энергии Гиббса и энтропии определяются с помощью следующей зависимости:

ΔG = ΔH-TΔS

Это означает, что ITC предлагает полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия для выяснения механизмов связывания (рисунок 1B). Определение сродства связывания для малых молекул с аптамером затруднено из-за резко различающихся размеров между аптамером и мишенью. Между тем, ITC может обеспечить чувствительное измерение без маркировки и иммобилизации молекул, что обеспечивает средства сохранения естественной структуры аптамера и мишени во время измерения. С указанными атрибутами ЦМТ может использоваться в качестве стандартного метода для характеристики связывания между аптамером и малыми мишенями.

После выбора группой Gu этот аптамер был интегрирован с различными платформами, включая биосенсоры на основе электрохимического аптамера, конкурентный анализ аптамера, связанный с ферментами, и микротитерную пластину, которая может обеспечить высокую пропускную способность обнаружения тетрациклина ^8,9,10. Однако его связующие характеристики не были выяснены достаточно хорошо, чтобы выбрать правильную платформу⁸; стоит охарактеризовать связывание аптамера с тетрациклином с помощью ITC.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.

1. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в одном буфере как для аптамера, так и для лиганда, с тем чтобы избежать выделения тепла, вызванного смешиванием различных буферов из ячейки образца и шприца. Обычно это достигается путем диализа всех материалов в один буфер. Буфер обменивается с помощью протокола, адаптированного из протокола концентратора отсечения молекулярной массы (MWC) 3 кДа с некоторыми модификациями, как показано ниже:

1. Активируйте мембрану диализной колонны (3 кДа MWC) с 1x PBS, pH 7,4, приобретенную у производителя, используя следующие этапы: заполнить 1x буфером (PBS), уравновесить в течение 10 мин при RT и центрифугу при 5000 x g в течение 15 мин.
2. Извлеките буфер и загрузите 500 мкл образцов аптамера в колонну, центрифугу при 5000 x g и повторите ее 4x, чтобы заменить исходный буфер на 1x PBS. Когда буфер проходит через мембрану, все молекулы с массой менее 3 кДа проходят через мембрану, а аптамер останется на верхней стороне мембраны.
3. Соберите диализированный АПТАМЕР ДНК с помощью пипетки и перенесите его в новую трубку (трубки) объемом 1,5 мл.
4. Соберите последний проточный буфер для растворения тетрациклина. Тетрациклиновый порошок чистый и мелкий, поэтому диализ не нужен. Однако используйте предыдущий диализованный буфер для ДНК для мишени, чтобы гарантировать, что буфер для эксперимента в шприце соответствует буферу в эталонной клетке.
5. Снова определите концентрацию аптамера с помощью УФ-видимого спектрометра. Используйте последний буфер обмена, чтобы отрегулировать концентрацию до 40 мкМ тетрациклина и 2 мкМ аптамера.
6. Сложите ДНК-аптамер нагреванием при 90 °C в течение 10 мин, охлаждением при 4 °C в течение 10 мин, а затем возвратом к RT в течение 20 мин.
7. Дегазировать сложенный аптамер и диализованный тетрациклин с помощью станции дегазации или вакуумного насоса, установленного на 600 мм рт.ст. при 25 °C в течение 25 мин для удаления растворенных газов.

2. Мойка инструмента и запуск тестового комплекта

1. Очистите отверстия растворителя, чтобы убедиться, что весь путь образца чист. Очистите, выбросив раствор отходов и загрузив их чистым метанолом, водой и буфером. Каждый порт содержит более 250 мл, чтобы обеспечить достаточное количество раствора для очистки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс очистки автоматически завершается программируемым пользователем программным обеспечением управления ITC.
2. Проверьте чистоту машины, запустив ITC с помощью буфера в буфер (т. Е. 1x PBS в 1x PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная базовая линия шума видна между крошечным буфером в пики впрыска буфера. Когда шприц титрования и канюли будут надлежащим образом очищены и полностью высохнут, исходный уровень будет стабильным; увеличение или уменьшение базового уровня отражает грязные приборы или пузырьки внутри инструмента, которые необходимо исправить перед запуском фактических образцов.
3. Проверьте точность машины со стандартным комплектом, который включает в себя EDTA и CaCl₂ (рисунок 3), используя программу по умолчанию и следуя инструкциям производителя.

3. Запуск образца для определения связывания между аптамером и тетрациклином

1. Установите рабочие параметры: скорость перемешивания 200 об/мин, работающая при 25 °C, 2 мкМ аптамера и 40 мкМ тетрациклина, 30 инъекций по 2,0 мкл каждая, время задержки 180 с.
2. Проверьте необходимые тома с помощью работающего калькулятора программ. С помощью этого рабочего параметра выполните измерение ITC с использованием 230 мкл тетрациклина 40 мкМ в шприце ITC и 485 мкл 2 мкМ аптамера в пробной ячейке ITC с использованием ITC.
3. Загрузите диализированные тетрациклиновые пластины шприца и сложенный аптамер в клетку образца, избегая пузырьков, используя пипетку.
4. Запустите инструмент ITC, нажав кнопку «Пуск» на программном обеспечении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс работы прибора ITC полностью автоматизирован после ручного заполнения пластин образцов эталонной ячейки и титранта.

4. Анализ данных с помощью программного обеспечения

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных, дважды щелкнув, чтобы начать анализ данных.
2. Откройте путь к сохраненным необработанным данным, чтобы узнать тенденцию привязки.
3. Откройте вкладку моделирования и используйте различные модели привязки, чтобы найти наиболее подходящую для кривой данных. Затем программное обеспечение автоматически вычисляет термограмму ITC и различные термодинамические параметры, включая энтальпию (ΔH), энтропию (ΔS), свободную энергию (ΔG), константу равновесного связывания (Ka) и стехиометрию.
4. Соберите термодинамические параметры, определенные на основе данных и информации о модели подгонки.
5. Создайте отчет, включающий изображения термограммы ITC и различных термодинамических параметров, как показано на рисунке 4 и в таблице 1.

Результаты

ITC обеспечивает точную константу разъединения (K_d), стехиометрию связывания и термодинамические параметры двухмолекулярных взаимодействий⁶. В этом примере аптамер, выбранный Kim et ^al.9,11, связывается с тетрациклином со сродством связ?...

Обсуждение

Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5