Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.
Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (Kd) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.
Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням 1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела 3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определения сродства аптамеров, включая ITC, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), колориметрическое титрование, микромасштабный термофорез (MST) и биослойную интерферометрию (BLI). Среди них ITC является одним из новейших методов определения термодинамической и кинетической ассоциации двух молекул в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием 6,7. В отличие от других методов, ITC может предложить сродство связывания, несколько сайтов связывания, а также термодинамическую и кинетическую ассоциацию (рисунок 1A). Из этих начальных параметров изменения свободной энергии Гиббса и энтропии определяются с помощью следующей зависимости:
ΔG = ΔH-TΔS
Это означает, что ITC предлагает полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия для выяснения механизмов связывания (рисунок 1B). Определение сродства связывания для малых молекул с аптамером затруднено из-за резко различающихся размеров между аптамером и мишенью. Между тем, ITC может обеспечить чувствительное измерение без маркировки и иммобилизации молекул, что обеспечивает средства сохранения естественной структуры аптамера и мишени во время измерения. С указанными атрибутами ЦМТ может использоваться в качестве стандартного метода для характеристики связывания между аптамером и малыми мишенями.
После выбора группой Gu этот аптамер был интегрирован с различными платформами, включая биосенсоры на основе электрохимического аптамера, конкурентный анализ аптамера, связанный с ферментами, и микротитерную пластину, которая может обеспечить высокую пропускную способность обнаружения тетрациклина 8,9,10. Однако его связующие характеристики не были выяснены достаточно хорошо, чтобы выбрать правильную платформу8; стоит охарактеризовать связывание аптамера с тетрациклином с помощью ITC.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.
1. Подготовка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в одном буфере как для аптамера, так и для лиганда, с тем чтобы избежать выделения тепла, вызванного смешиванием различных буферов из ячейки образца и шприца. Обычно это достигается путем диализа всех материалов в один буфер. Буфер обменивается с помощью протокола, адаптированного из протокола концентратора отсечения молекулярной массы (MWC) 3 кДа с некоторыми модификациями, как показано ниже:
2. Мойка инструмента и запуск тестового комплекта
3. Запуск образца для определения связывания между аптамером и тетрациклином
4. Анализ данных с помощью программного обеспечения
ITC обеспечивает точную константу разъединения (Kd), стехиометрию связывания и термодинамические параметры двухмолекулярных взаимодействий6. В этом примере аптамер, выбранный Kim et al.9,11, связывается с тетрациклином со сродством связ?...
Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объек...
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' | Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены