Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны основные этапы эксперимента ITC по определению термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина.
1. Подготовка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для КВТ должны быть подготовлены в ...

<ol>
	<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands.">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li><li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil.">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science &amp; Health. 10, 9-21 (2019).</li><li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology.">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX--A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li><li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry:+Allostery,+inhibition,+and+dynamics.">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li><li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines.">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection.">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey.">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline.">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li><li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer.">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272 (2017).</li><li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+and+thermodynamics+of+2',5'+RNA+intercalation.">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li><li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry.">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li><li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li><li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides.">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li></ol>

Метод, представленный здесь, был модифицирован в соответствии с инструкцией от TA Instruments и достаточен для определения сродства связывания и термодинамики многих выбранных аптамеров и мишеней в нашем центре. Важные шаги из этой процедуры включают обмен буфером, чтобы иметь целевой объек...

Аптамеры представляют собой фрагменты сдНК или РНК, отобранные в процессе эволюции с высоким сродством связывания и специфичностью к желаемым мишеням 1,2, которые могут работать как элементы расширенного распознавания или химические антитела 3,4,5. Таким образом, сродство связывания и специфичность аптамеров с их мишенями играют решающую роль в выборе и применении аптамера, и изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется для этих целей характеристики. Многие подходы были использованы для определения сродства аптамеров, включая ITC, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), колориметрическое титрование, микромасштабный термофорез (MST) и биослойную интерферометрию (BLI). Среди них ITC является одним из новейших методов определения термодинамической и кинетической ассоциации двух молекул в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием 6,7. В отличие от других методов, ITC может предложить сродство связывания, несколько сайтов связывания, а также термодинамическую и кинетическую ассоциацию (рисунок 1A). Из этих начальных параметров изменения свободной энергии Гиббса и энтропии определяются с помощью следующей зависимости:
ΔG = ΔH-TΔS
Это означает, что ITC предлагает полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия для выяснения механизмов связывания (рисунок 1B). Определение сродства связывания для малых молекул с аптамером затруднено из-за резко различающихся размеров между аптамером и мишенью. Между тем, ITC может обеспечить чувствительное измерение без маркировки и иммобилизации молекул, что обеспечивает средства сохранения естественной структуры аптамера и мишени во время измерения. С указанными атрибутами ЦМТ может использоваться в качестве стандартного метода для характеристики связывания между аптамером и малыми мишенями.
После выбора группой Gu этот аптамер был интегрирован с различными платформами, включая биосенсоры на основе электрохимического аптамера, конкурентный анализ аптамера, связанный с ферментами, и микротитерную пластину, которая может обеспечить высокую пропускную способность обнаружения тетрациклина 8,9,10. Однако его связующие характеристики не были выяснены достаточно хорошо, чтобы выбрать правильную платформу8; стоит охарактеризовать связывание аптамера с тетрациклином с помощью ITC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5&#39;-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG 
			C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG 
			TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>The sequence is adopted from Gu&#39;s research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &#181;L) System Complete&#8211;Gold Cells</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>61000.901</td>
			<td>Isothermal titration calorimetry system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Avantor (VWR)</td>
			<td>E506-100ML</td>
			<td>Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Degassing Station (110/230V)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6326</td>
			<td>This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>TekNova</td>
			<td>E0375</td>
			<td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>OD030C34</td>
			<td>3 kDa molecular weight cutoff concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB70165</td>
			<td>Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 &#181;m filter. Autoclaved at 121 &#176;C for greater than 20 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>labForce (a Thomas Scientific Brand)</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, Hydrochoride</td>
			<td>EMD Millipore Corperation</td>
			<td>CAS64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the thermodynamic and kinetic association of a dna aptamer and tetracycline using isothermal titration calorimetry

Определение сродства связывания и поведения между аптамером и его мишенью является наиболее важным шагом в выборе и использовании аптамера для применения. Из-за резких различий между аптамером и малыми молекулами ученым необходимо приложить много усилий для характеристики их связывающих свойств. Изотермическая титрующая калориметрия (ITC) является мощным подходом для этой цели. ITC выходит за рамки определения констант диссоциации (Kd) и может обеспечить изменения энтальпии и стехиометрию связывания взаимодействия между двумя молекулами в фазе раствора. Этот подход проводит непрерывное титрование с использованием молекул без меток и регистрирует выделяемое тепло с течением времени при событиях связывания, производимых каждым титрованием, поэтому процесс может чувствительно измерять связывание между макромолекулами и их небольшими мишенями. В статье представлена пошаговая процедура измерения ITC выбранного аптамера с малой мишенью, тетрациклином. Этот пример доказывает универсальность методики и ее потенциал для других применений.

ITC обеспечивает точную константу разъединения (Kd), стехиометрию связывания и термодинамические параметры двухмолекулярных взаимодействий6. В этом примере аптамер, выбранный Kim et al.9,11, связывается с тетрациклином со сродством связ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry at JoVE.com

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Настоящий протокол описывает использование изотермической титрационной калориметрии (ITC) для анализа кинетики ассоциации и диссоциации связывания между аптамером ДНК и тетрациклином, включая подготовку образцов, текущие стандарты и образцы, а также интерпретацию полученных данных.

Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Этот протокол позволяет исследователям определять сродство связывания аптамеров с мишенями, свободными в растворе, обеспечивая при этом понимание механизма связывания. Поскольку ITC измеряет изменения тепла из-за связывания, ни аптамер, ни лиганд не должны быть маркированы или функционализированы, как это было бы в случае с такими методами, как SPR. Новые пользователи должны обратить пристальное внимание на сопоставление буферов во всех компонентах привязки.Кроме того, имейте в виду, что метод имеет высокие требования к образцам, которые может быть трудно удовлетворить для более крупных лигандов, таких как белки. Для начала активируют мембрану диализной колонны, заполняют буфером PBS, уравновешивают в течение 10 минут при комнатной температуре и центрифугу в 5 000 раз g в течение 15 минут. Снимите буфер и загрузите в колонну 500 микролитров образцов аптамера.Центрифуга при 5 000 G и повторите ее четыре раза, чтобы обменять исходный буфер на PBS. Соберите диализированный АПТАМЕР ДНК с помощью пипетки и перенесите его в новую 1,5-миллилитровую трубку. Соберите последний проточный буфер для растворения тетрациклина.Убедитесь, что буфер для эксперимента в шприце соответствует буферу в ячейке ссылки. Снова определите концентрацию аптамера с помощью УФ-видимого спектрометра. Используйте последний обменный буфер для регулировки концентрации до 40-микромолярного тетрациклина и двухмикролярного аптамера.Сложите ДНК-аптамер, нагревая при 90 градусах Цельсия в течение 10 минут, охлаждая при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем возвращаясь к комнатной температуре в течение 20 минут. Дегазировать сложенный аптамер и диализованный тетрациклин с помощью станции дегазации или вакуумного насоса в течение 25 минут для устранения растворенных газов. После очистки и подтверждения чистоты машины, проверьте точность машины со стандартным комплектом, который включает ЭДТА и хлорид кальция, используя программу по умолчанию и следуя инструкциям производителя.Настройте параметры выполнения. Проверьте необходимые тома с помощью работающего калькулятора программ. С помощью этого параметра выполнения измерения ITC с помощью 230 микролитров 40-микромолярного тетрациклина в шприце ITC и 485 микролитров двухмикролярного аптамера в образце ячейки ITC с использованием ITC.Загрузите диализированные тетрациклиновые пластины шприца и сложенный аптамер в клетку образца, избегая пузырьков, используя пипетку. Запустите инструмент ITC, нажав кнопку Пуск на программном обеспечении. Откройте программное обеспечение для анализа данных, дважды щелкнув, чтобы начать анализ данных.Откройте путь к сохраненным необработанным данным, чтобы узнать тенденцию привязки. Откройте вкладку Моделирование и используйте различные модели привязки, чтобы найти наиболее подходящую для кривой данных. Затем программное обеспечение автоматически вычисляет термограмму ITC и различные термодинамические параметры, включая энтальпию, энтропию, свободную энергию, константу равновесного связывания и стехиометрию.Соберите термодинамические параметры, определенные на основе данных и информации о модели подгонки. Создайте отчет, включающий изображения термограммы ITC и различные термодинамические параметры. Аптамер, выбранный Кимом и др., связывается с тетрациклином со сродством связывания константы диссоциации один равен 13 микромолярам, а константа диссоциации два равна 53 наномолярам.Модель подгонки и стехиометрия от ITC отражают, что аптамер связывается с тетрациклином через соотношение связывания 2:1 с моделью последовательного связывания. Термодинамические параметры, определенные в результате измерений ITC для второго участка, показали, что энтальпия, преодолевающая относительно значительные энтропийные потери, приводит к сильному связыванию. Энтальпийное связывание с потерей энтропии связано с конформационными изменениями нуклеиновых кислот, которые, как сообщалось, являются поведением связывания между РНК и небольшой молекулой.Аптамер и лиганд должны находиться в одном буфере. Аптамер должен быть повторно свернут, если он развился с повторным складыванием, а образцы должны быть дегазированы. Рассмотрение этих соображений гарантирует, что только взаимодействия аптамер-лиганд способствуют измеряемому сигналу.Из-за размера мишени аптамера подходящим последующим методом может быть микромасштабный термофорез для подтверждения измеренного сродства связывания в растворе.

Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

Abstract