A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.
פרוטוקול זה נועד לבסס שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2, תוך שימוש בנוגדנים המדווחים על שינויים קונפורמטיביים וציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה. השיטה יכולה לשמש גם כמדריך לשיטות סינון אחרות מבוססות נוגדנים בתפוקה גבוהה. אינטגרינים β2 הם מולקולות הידבקות ספציפיות לויקוציטים החיוניות לתגובות חיסוניות. נויטרופילים מסתמכים על הפעלת אינטגרין כדי לצאת מזרם הדם, לא רק כדי להילחם בזיהומים אלא גם כדי להיות מעורבים במחלות דלקתיות מרובות. שליטה בהפעלת אינטגרין β2 מציגה גישה בת קיימא לטיפול במחלות דלקתיות הקשורות לנויטרופילים. בפרוטוקול זה, נוגדן חד-שבטי, mAb24, אשר נקשר באופן ספציפי לכיסוי הראש בעל הזיקה הגבוהה של אינטגרינים β2, משמש לכימות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים ראשוניים מבודדים. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) משמש כגירוי להפעלת אינטגרינים β2 נויטרופילים. במחקר זה נעשה שימוש בציטומטר זרימה בתפוקה גבוהה המסוגל להריץ באופן אוטומטי דגימות לוחות של 384 בארות. ההשפעות של 320 כימיקלים על עיכוב אינטגרין β2 מוערכות תוך 3 שעות. באמצעות גישה זו ניתן לזהות מולקולות התוקפות ישירות לאינטגרינים β2 או מולקולות מטרה במסלול איתות ההפעלה מבפנים החוצה המופעל על ידי קולטן G המצומד לחלבון.
מחלות דלקתיות רבות מאופיינות בחדירת נויטרופילים באתר של נפיחות או פציעה1. כדי לחדור לרקמות אלה, נויטרופילים חייבים להשלים את מפל גיוס הנויטרופילים, הכולל מעצר לאנדותל, אקסטרווזיה על פני דופן כלי הדם, וגיוס לרקמה2. נויטרופילים במחזור הדם זקוקים להפעלת אינטגרין β2 כדי להשלים מפל זה, במיוחד עבור שלב המעצר. לפיכך, תרופות מעכבות אינטגרין המפחיתות הידבקות נויטרופילים, אקסטרווציה וגיוס עשויות לטפל ביעילות במחלות דלקתיות 3,4.
אינטגרינים β2 היו יעד למחלות דלקתיות בעבר. Efalizumab, נוגדן חד שבטי המכוון ישירות לאינטגרין αLβ2, פותח לטיפול בפסוריאז....
דגימות דם מלא הופרינו התקבלו מתורמים אנושיים בריאים שעברו ביטול זיהוי לאחר קבלת הסכמה מדעת, כפי שאושרה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UConn Health, בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. התקבלה הסכמה מדעת מכל התורמים. קריטריוני ההכללה/אי-הכללה במחקר זה פותחו בקפידה כדי להבטיח את התאמת המשתתפים ולמזער ?.......
נתונים מבדיקת לוחות 384 בארות מייצגת (איור 4) גילו כי לבקרות שליליות היה MFI של mAb24-APC של 3236 ± 110, בעוד שלבקרות חיוביות היה MFI של mAb24-APC של 7588 ± 858. מקדם Z' עבור צלחת זו הוא בערך 0.33, שהוא בטווח מקובל31. עם זאת, Z' דורש אימות נוסף במבחני משנה.
כדי לנרמל את הנתונים,.......
ההתחלה והסיום של גירוי נויטרופילים וצביעה נקבעים על ידי תוספת של נויטרופילים ו- PFA קיבוע. לכן, הבטחת מרווח זמן זהה בין צנרת נויטרופילים או PFA לתוך כל עמודה היא קריטית. זה מבטיח שהגירוי וזמן הצביעה של נויטרופילים מכל באר יישאר עקבי. בשל תוחלת החיים הקצרה של נויטרופילים, הניסוי כולו, החל מאיסו?.......
אנו מודים לד"ר אוון ג'ליסון וגב' לי ג'ו בליבת ציטומטריית הזרימה ב- UConn Health על עזרתם בציטומטריית זרימה, לד"ר לין פודינגטון במחלקה לאימונולוגיה ב- UConn Health על תמיכתה במכשירים, לגב' סלאווה גאייבסקה ולד"ר פול אפלטון בליבת המחקר הקליני ב- UConn Health על עזרתם בהשגת דגימות דם. אנו מודים לד"ר כריסטופר "קיט" בונין ולד"ר ז'נבה הרגיס מבית הספר לרפואה של UConn על עזרתם בכתיבה מדעית ובעריכה של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01HL145454), המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (P20GM121176), ארה"ב, פרס פיתוח קריירה מאיגוד הלב האמריקאי (18CDA34110426), וקרן סטארט-אפ מ- UConn Health. איור 1 נוצר באמ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved