Una tecnica ad alto rendimento basata sulla citometria a flusso per lo screening di farmaci inibitori delle integrine

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 sui neutrofili umani.

Abstract

Questo protocollo mira a stabilire un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina β2, utilizzando anticorpi conformazionali che segnalano cambiamenti e citometria a flusso ad alto rendimento. Il metodo può anche fungere da guida per altri metodi di screening ad alto rendimento basati su anticorpi. Le integrine β2 sono molecole di adesione specifiche per i leucociti che sono cruciali nelle risposte immunitarie. I neutrofili si affidano all'attivazione delle integrine per uscire dal flusso sanguigno, non solo per combattere le infezioni, ma anche per essere coinvolti in molteplici malattie infiammatorie. Il controllo dell'attivazione dell'integrina β2 rappresenta un approccio praticabile per il trattamento delle malattie infiammatorie associate ai neutrofili. In questo protocollo, un anticorpo monoclonale, mAb24, che si lega specificamente al copricapo ad alta affinità delle integrine β2, viene utilizzato per quantificare l'attivazione dell'integrina β2 su neutrofili umani primari isolati. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) viene utilizzata come stimolo per attivare le integrine β2 dei neutrofili. In questo studio è stato utilizzato un citometro a flusso ad alto rendimento in grado di eseguire automaticamente campioni di piastre a 384 pozzetti. Gli effetti di 320 sostanze chimiche sull'inibizione dell'integrina β2 sono valutati entro 3 ore. Attraverso questo approccio è possibile identificare le molecole che prendono di mira direttamente le integrine β2 o le molecole bersaglio nella via di segnalazione di attivazione inside-out dell'integrina avviata dal recettore accoppiato alla proteina G.

Introduction

Molte malattie infiammatorie sono caratterizzate dall'infiltrazione di neutrofili nel sito di gonfiore o lesione¹. Per infiltrarsi in questi tessuti, i neutrofili devono completare la cascata di reclutamento dei neutrofili, che comporta l'arresto dell'endotelio, lo stravaso attraverso la parete del vaso e il reclutamento nel tessuto². I neutrofili circolanti hanno bisogno dell'attivazione dell'integrina β2 per completare questa cascata, specialmente per la fase di arresto. Pertanto, i farmaci inibitori dell'integrina che riducono l'adesione, lo stravaso e il reclutamento dei neutrofili possono trattare efficacemente le m....

Protocol

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani non identificati dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health, seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori. I criteri di inclusione/esclusione per questo studio sono stati accuratamente sviluppati per garantire l'idoneità dei partecipanti e per ridurre al minimo i rischi potenziali. I partecipanti idonei avevan.......

Discussion

L'inizio e la fine della stimolazione e della colorazione dei neutrofili sono determinati dall'aggiunta di neutrofili e del fissativo PFA. Pertanto, è fondamentale garantire lo stesso intervallo di tempo tra il pipettaggio dei neutrofili o del PFA in ciascuna colonna. Ciò garantisce che il tempo di stimolazione e colorazione dei neutrofili da ciascun pozzetto rimanga costante. A causa della breve durata di vita dei neutrofili, l'intero esperimento, dalla raccolta del sangue dai donatori al completamento della citometri.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument