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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 sui neutrofili umani.

Abstract

Questo protocollo mira a stabilire un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell'attivazione dell'integrina β2, utilizzando anticorpi conformazionali che segnalano cambiamenti e citometria a flusso ad alto rendimento. Il metodo può anche fungere da guida per altri metodi di screening ad alto rendimento basati su anticorpi. Le integrine β2 sono molecole di adesione specifiche per i leucociti che sono cruciali nelle risposte immunitarie. I neutrofili si affidano all'attivazione delle integrine per uscire dal flusso sanguigno, non solo per combattere le infezioni, ma anche per essere coinvolti in molteplici malattie infiammatorie. Il controllo dell'attivazione dell'integrina β2 rappresenta un approccio praticabile per il trattamento delle malattie infiammatorie associate ai neutrofili. In questo protocollo, un anticorpo monoclonale, mAb24, che si lega specificamente al copricapo ad alta affinità delle integrine β2, viene utilizzato per quantificare l'attivazione dell'integrina β2 su neutrofili umani primari isolati. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) viene utilizzata come stimolo per attivare le integrine β2 dei neutrofili. In questo studio è stato utilizzato un citometro a flusso ad alto rendimento in grado di eseguire automaticamente campioni di piastre a 384 pozzetti. Gli effetti di 320 sostanze chimiche sull'inibizione dell'integrina β2 sono valutati entro 3 ore. Attraverso questo approccio è possibile identificare le molecole che prendono di mira direttamente le integrine β2 o le molecole bersaglio nella via di segnalazione di attivazione inside-out dell'integrina avviata dal recettore accoppiato alla proteina G.

Introduction

Molte malattie infiammatorie sono caratterizzate dall'infiltrazione di neutrofili nel sito di gonfiore o lesione1. Per infiltrarsi in questi tessuti, i neutrofili devono completare la cascata di reclutamento dei neutrofili, che comporta l'arresto dell'endotelio, lo stravaso attraverso la parete del vaso e il reclutamento nel tessuto2. I neutrofili circolanti hanno bisogno dell'attivazione dell'integrina β2 per completare questa cascata, specialmente per la fase di arresto. Pertanto, i farmaci inibitori dell'integrina che riducono l'adesione, lo stravaso e il reclutamento dei neutrofili possono trattare efficacemente le m....

Protocol

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani non identificati dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health, seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori. I criteri di inclusione/esclusione per questo studio sono stati accuratamente sviluppati per garantire l'idoneità dei partecipanti e per ridurre al minimo i rischi potenziali. I partecipanti idonei avevan.......

Representative Results

I dati di uno screening rappresentativo su piastra a 384 pozzetti (Figura 4) hanno rivelato che i controlli negativi avevano un MFI di mAb24-APC di 3236 ± 110, mentre i controlli positivi avevano un MFI di mAb24-APC di 7588 ± 858. Il fattore Z' per questa piastra è di circa 0,33, che rientra in un intervallo accettabile31. Tuttavia, Z' richiede un'ulteriore convalida nei saggi secondari.

Per normalizzare i dati, tutti i valori sono stati.......

Discussion

L'inizio e la fine della stimolazione e della colorazione dei neutrofili sono determinati dall'aggiunta di neutrofili e del fissativo PFA. Pertanto, è fondamentale garantire lo stesso intervallo di tempo tra il pipettaggio dei neutrofili o del PFA in ciascuna colonna. Ciò garantisce che il tempo di stimolazione e colorazione dei neutrofili da ciascun pozzetto rimanga costante. A causa della breve durata di vita dei neutrofili, l'intero esperimento, dalla raccolta del sangue dai donatori al completamento della citometri.......

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Evan Jellison e la Sig.ra Li Zhu nel nucleo di citometria a flusso presso UConn Health per la loro assistenza con la citometria a flusso, la Dott.ssa Lynn Puddington nel Dipartimento di Immunologia presso UConn Health per il suo supporto agli strumenti, la Sig.ra Slawa Gajewska e il Dr. Paul Appleton nel nucleo di ricerca clinica presso UConn Health per il loro aiuto nell'ottenere campioni di sangue. Ringraziamo il Dr. Christopher "Kit" Bonin e la Dr.ssa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il loro aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Inst....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16-channel pipettesThermo4661090NInstrument
384-well plateGreiner784201Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24BioLegend363410Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform Agilent16050-102384 multi-channel liquid handler
CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
FlowJoBecton, Dickinson & CompanyNASoftware
Human Serum Albumin Solution (25%)GeminiBio800-120Reagents
LifitegrastThermofisher 50-208-2121Reagents
Nexinhib20Tocris6089Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)SigmaF3506Reagents
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences15710Reagents
Plate bucketsEppendorfUL155Accessory
Plate shaker Fisher88-861-023Instrument
PolymorphPrepPROGEN1895 (previous 1114683)Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)Prestwick Chemical LibrariesVer19_3841520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol redGibco11-835-030Reagents
Swing-bucket rotor EppendorfA-4-62Rotor
ZE5 Cell AnalyzerBio-Rad LaboratoriesModel ZE5Instrument

References

  1. Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).
  2. Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).
  3. Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology & Therapeutics. 147, 123-135 (2015).
  4. Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunitie....

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