Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Summary

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Abstract

Este protocolo visa estabelecer um método para identificar pequenos antagonistas moleculares da ativação de integrinas β2, utilizando anticorpos notificadores de mudança conformacional e citometria de fluxo de alto rendimento. O método também pode servir como um guia para outros métodos de triagem de alto rendimento baseados em anticorpos. As integrinas β2 são moléculas de adesão leucocitárias específicas que são cruciais na resposta imune. Os neutrófilos dependem da ativação da integrina para sair da corrente sanguínea, não apenas para combater infecções, mas também para estar envolvidos em múltiplas doenças inflamatórias. O controle da ativação das integrinas β2 apresenta uma abordagem viável para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a neutrófilos. Nesse protocolo, um anticorpo monoclonal, mAb24, que se liga especificamente ao headpiece de alta afinidade das integrinas β2, é utilizado para quantificar a ativação da integrina β2 em neutrófilos humanos primários isolados. N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) é usado como um estímulo para ativar integrinas β2 neutrófilos. Um citômetro de fluxo de alto rendimento capaz de executar automaticamente amostras de placas de 384 poços foi usado neste estudo. Os efeitos de 320 produtos químicos na inibição da integrina β2 são avaliados dentro de 3 h. Moléculas que têm como alvo direto integrinas β2 ou moléculas-alvo na via de sinalização de ativação de dentro para fora da integrina iniciada pelo receptor acoplado à proteína G podem ser identificadas através desta abordagem.

Introduction

Muitas doenças inflamatórias são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos no local do edema ou lesão¹. Para infiltração desses tecidos, os neutrófilos devem completar a cascata de recrutamento de neutrófilos, que envolve parada no endotélio, extravasamento através da parede do vaso e recrutamento para o tecido². Os neutrófilos circulantes necessitam da ativação da integrina β2 para completar essa cascata, especialmente para a fase de parada. Assim, drogas inibidoras de integrinas que reduzem a adesão, o extravasamento e o recrutamento de neutrófilos podem efetivamente tratar doenças inflamat....

Protocol

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis não identificados após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UConn Health, seguindo os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os doadores assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de inclusão/exclusão deste estudo foram cuidadosamente desenvolvidos para garantir a adequação dos participantes e minimizar potenciais riscos. Os participantes.......

Discussion

O início e o término da estimulação e coloração de neutrófilos são determinados pela adição de neutrófilos e do PFA fixador. Portanto, garantir o mesmo intervalo de tempo entre a pipetagem de neutrófilos ou PFA em cada coluna é fundamental. Isso garante que o tempo de estimulação e coloração dos neutrófilos de cada poço permaneça consistente. Devido ao curto tempo de vida dos neutrófilos, todo o experimento, desde a coleta de sangue de doadores até a conclusão da citometria de fluxo, deve ser reali.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16-channel pipettes	Thermo	4661090N	Instrument
384-well plate	Greiner	784201	Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24	BioLegend	363410	Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform	Agilent	16050-102	384 multi-channel liquid handler
Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R	Instrument
FlowJo	Becton, Dickinson & Company	NA	Software
Human Serum Albumin Solution (25%)	GeminiBio	800-120	Reagents
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reagents
Nexinhib20	Tocris	6089	Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reagents
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagents
Plate buckets	Eppendorf	UL155	Accessory
Plate shaker	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (previous 1114683)	Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red	Gibco	11-835-030	Reagents
Swing-bucket rotor	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad Laboratories	Model ZE5	Instrument