Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Осуществимость стратегий секвенирования всего генома (WGS) с использованием настольных инструментов упростила опрос генома каждого микроба, имеющего отношение к общественному здравоохранению в лабораторных условиях. Описана методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS и представлен конвейер биоинформатики для анализа.

Abstract

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, а выращивание тилапии (Oreochromis spp.) представляет собой основной культивируемый сорт пресноводных рыб. Поскольку практика аквакультуры восприимчива к микробному загрязнению, полученному из антропогенных источников, необходимо широкое использование антибиотиков, что приводит к тому, что системы аквакультуры становятся важным источником устойчивых к антибиотикам и патогенных бактерий, имеющих клиническое значение, таких как Escherichia coli (E. coli). Здесь устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli , извлеченного из внутреннего выращивания Oreochromis spp., были выяснены с помощью секвенирования всего генома (WGS) и анализа in silico . Было проведено тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (AST) и WGS. Кроме того, филогенетическая группа, серотип, типирование многолокусных последовательностей (MLST), приобретенная устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность, содержание плазмиды и профагов были определены с использованием различных доступных веб-инструментов. Изолят E. coli проявлял только промежуточную восприимчивость к ампициллину и характеризовался как штамм ONT:H21-B1-ST40 путем типирования на основе WGS. Хотя был обнаружен только один ген, связанный с устойчивостью к противомикробным препаратам [mdf(A)], было идентифицировано несколько вирулентно-ассоциированных генов (VAG) из атипичного энтеропатогенного патотипа E. coli (aEPEC). Кроме того, был обнаружен груз плазмидных репликонов из крупных плазмидных групп и 18 профаго-ассоциированных областей. В заключение, характеристика WGS изолята aEPEC, извлеченного с рыбной фермы в Синалоа, Мексика, позволяет понять его патогенный потенциал и возможный риск для здоровья человека, связанный с потреблением сырых аквакультурных продуктов. Необходимо использовать методы секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения микроорганизмов окружающей среды и принять единую систему здравоохранения, чтобы узнать, как возникают проблемы со здоровьем.

Introduction

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, и ее производственная практика предназначена для удовлетворения растущего спроса на продовольствие для потребления человеком. Мировое производство аквакультуры утроилось с 34 миллионов тонн в 1997 году до 112 тонн в 2017году1. Основными группами видов, на которые приходилось почти 75% производства, были морские водоросли, карпы, двустворчатые моллюски, сом и тилапия (Oreochromis spp.) 1. Однако появление заболеваний, вызванных микробными образованиями, неизбежно из-за интенсивного рыбоводства, что приводит к....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм E. coli ACM5 был извлечен путем обработки и культивирования образца рыбы для определения фекальной кишечной палочки (FC)12. Во время отбора проб рыбы у рыбы не было клинических признаков заболевания, бактериальной или грибковой инфекции, и преобладала средняя температура 22,3 ° C. После выделения изолят E. coli подвергали биохимическому тестированию и криоконсервировали в отваре для инфузии сердца мозга (BHI) с ДМСО (8% v/v) в качестве криопротекторного средства.

1. Реактивация замороженной культуры E. coli ACM5

  1. Из замороженного бактериального бу....

Representative Results

Антимикробную восприимчивость определяли методом дисковой диффузии и интерпретировали по критериям точки разрыва CLSI для 12 антибиотиков, охватывающих шесть различных классов противомикробных препаратов, то есть аминогликозиды, β-лактамы, фторхинолоны, нитрофураны, фениколы и антаго?.......

Discussion

В этом исследовании представлена адаптация рабочего процесса бактериальной WGS с использованием настольного секвенсора и конвейера для геномной характеристики патогенного варианта E. coli . В зависимости от используемой платформы секвенирования время выполнения (TATs) для влажных ла?.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Национальному совету по науке и технике Мексики (CONACyT по его аббревиатуре на испанском языке) за докторскую стипендию, присужденную Хосе Антонио Маганья-Лисарраге [No 481143].

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accublock Mini digital dry bathLabnetD0100Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11DeNovix Inc.UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind TubesEppendorf00301084181.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DMagnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.Diagnostic reseach (Mexico)PT-35Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)IlluminaFC-420-1004Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System InstrumentIlluminaSY-420-1001Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifugeEppendorf5452000816Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Index set A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001DNA library control for sequencing
Precision waterbathLabCare America51221081Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubesInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ328560.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerat....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190Escherichia coliaEPECOreochromis spp

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved